核酸分子杂交技术2016-李.pptVIP

9. 滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗。 10. 滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃60分钟或20℃左右120分钟。05M PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。 11. 滴加SABC：37℃20分钟或20℃左右30分钟。0.5M PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。 12. 滴加生物素化过氧化物酶：37℃20或20℃左右30分钟。0.5M PBS洗5分钟×4次。 13. DAB显色: 使用DAB显色试剂盒1ml蒸馏水加显色剂A、B、C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。 14. 必要时苏木素更染，充分水洗。 15. 酒精脱水，二甲苯透明，封片。 二、石蜡切片 如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4％多聚甲醛/0.1M PBS（pH7.0-7.4），含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定2小时即可，较大的标本固定不要超过4小时。某些组织对过度固定大其敏感，如动物大脑，固定时间一定不要超过1小时。 1. 常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。 2. 玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。 3. 石蜡切片经常规脱蜡至水。3%H2O2室温处理10分钟。蒸馏水洗涤2次。 4. 暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3％柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃消化10-60分钟。用户可以比较不同的消化时间，例如10分钟，20分钟，30分钟和60分钟，以找到最佳的消化时间。0.5M PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。 其余步骤和冰冻切片6-15步相同。 结果观察：BCL-2 mRNA的细胞胞浆着色呈棕黄色。 注意事项：如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。有其它明显的非特异性染色现象时，可以用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2-5倍。 3. ABC显色体系 DNA-B+SA-AP→DNA-B-SA或 DNA-B+SA+BAP→DNA-B-SA-BAP SA：streptavidin(链霉亲合素) BAP：生物素化的磷酸酶 B：biotin(生物素), ABC:avidin-botin-enzyme complex(亲合素-生物素-酶复合物)。 4.非放射发光自显影 若将AP或HRP的显色底物根据光化学原理换成一种酶解后产生的光子的化合物，可用自显影技术曝光X线片显示。 HRP发光自显影：氨基苯-甲酰肼在HRP与H2O2作用下氧化为氨基苯二甲酸，同时放出N2及发光。 AP发光自显影：发光底物金刚烷二氧丁环磷酸盐（AMPDD），其磷酸二脂键在AP作用下水解一个磷酸，进而由分子内过氧键提供能源分解并产生金刚酮和激发态的甲基间-氧苯甲酸阴离子，恢复到基态时发光。 五、核酸分子杂交方法和类型 （一）、固相膜核酸分子杂交 将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸链游离在溶液中。 固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒，磁珠和微孔板等。杂交后未杂交的游离片断容易洗去，膜上留下的杂交物容易检测，并能防止和DNA自我复性等优点，故该法最为常用。 类型：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、细胞或组织原位杂交和夹心杂交等。 方法： 1. DNA变性：变性能使DNA双链解开，常用SSC（0.1mol/L SSC, 15mmol NaCl-1.5mmol 柠檬酸三钠）碱变性。 2. 膜上固定： 20×SSC中转膜-毛细现象，固定，80℃下，2小时或紫外线下1分钟（Cross link）。 3. 预杂交：塑料袋中预热60℃，预杂交液中：6×SSC，0.01molEDTA，5×Denhardt氏液，0.5％SDS，100 μg/ml变性鲑鱼精DNA 4. 杂交：杂交液中的组成：6×SSC，0.01molEDTA，5×Denhardt氏液，0.5％SDS，100 μg/ml变性鲑鱼精DNA及探针。 5. 洗膜：2×SSC-0.5％SDS， 0.1×SSC-0.5％SDS，60℃ 2小时。 6. 显色：放射自显影；感光显影。 种类： A：菌落原位杂交(Colony in situ hybridization)：是将细菌从培养平板中转移到硝酸纤维素膜上，然后再将滤膜上的菌落裂解以释放出DNA。将DNA烘干固定膜上与标记的探针杂交，放射自显影，检测杂交信号，与平板上的菌落对位。 B：斑点杂交(Dot blot)：是