四种药用野生蕨类植物的组织培养探究.pdf

四种药用野生蕨类植物的组织培养研究 专业:生物化学与分子生物学 研究方向: 植物基因工程 年级:2006级 导师:王任翔 教授 研究生:陆碧云 中文摘要 药用蕨类植物一直作为传统中药被沿用至今。随着新技术新方法在植物药用成分分离 分析上的应用，越来越多蕨类植物所含的药用成分被发现，人们对药用蕨类植物的需求也 正愈来增加。由于被肆意开采、其生态环境正被严重破坏，许多野生药用蕨类植物种类面 临灭绝的厄运，更满足不了中药材市场的需求。组织培养为野生药用蕨类植物基础研究、 保护和开发利用提供必要的手段。本文从4种药用凤尾蕨属(Pteris L.)植物的成熟孢子组织 培养开始，利用组织培养技术、显微摄像、制片技术等实验手段，研究其配子体 (Gametophyte,G)发育、配子体增殖和配子体愈伤组织及孢子体诱导等；其中大半边旗(Pteris dissitifolia Bak.)和傅氏凤尾蕨(Pteris fauriei Hieron.) 配子体在不含植物激素培养基中形成 的愈伤组织诱导胚状体(Embryoid,E)形态发生的组织细胞学观察，是国内首次对蕨类植物 胚状体进行的研究。主要结论如下： （1）大半边旗(Pteris dissitifolia Bak.) 大半边旗成熟孢子在 1/2 MS 和 1/2 MS 大量元素两种固体培养基中都能萌发并最终形 成孢子体。在 1/2 MS 大量元素+1%(w/v) 蔗糖的培养基中，孢子萌发为书带蕨型 (Vittaria-type)，配子体发育为水蕨型(Ceratopteris-type) 。植物激素诱导配子体形成粘质、水 浸状的黄绿色愈伤组织(Callus,C)，但这些愈伤组织在 GA 0.1mg·L-1 +1/2 MS 大量元素+3% 3 蔗糖的固体培养基中不能分化形成孢子体。孢子在 1/2 MS 大量元素+1%蔗糖的固体培养基 中培养约 11 周形成的配子体，其中有些配子体上形成一些乳白色的愈伤组织。这些愈伤组 织能在 GA3 0.1mg·L-1 +1/2 MS 大量元素+3%蔗糖的固体培养基中分化形成胚状体，最终发 育成完整的孢子体苗。组织细胞学观察发现，胚状体形态发生过程具有类似合子胚胎发育 的四细胞期(Quadrant stage)、球形胚胎(Spherical-shaped embryo stage)、心形胚(Heart-shaped embryo stage)、鱼雷胚(Torpedo-shaped embryo stage)、成熟胚胎(Mature embryo)各阶段；胚 状体发育早期就出现极性(Polarity)和管状分子(Tracheary elements,Tes)；同一培养物上可以 看到不同发育时期和不同大小的胚状体。 （2 ）傅氏凤尾蕨(Pteris fauriei Hieron.) 在 1/2MS 固体培养中，傅氏凤尾蕨孢子萌发方式为书带蕨型，配子体发育是有些类 似三叉蕨型(Aspidium-type) 的一种，近成熟配子体腹面近凹口处分生区处有一个由许多颗 粒状细胞组成并长有许多多细胞毛状体的突起结构，极少数配子体上此突起部位发现个别 颈卵器(Archegonia) 。孢子萌发和配子体发育都能耐受较大变化的酸性培养环境。傅氏凤尾 蕨配子体形成孢子体都与上述突起结构有关；在无激素的 1/2MS 固体培养条件下，该结构 除了长出极少数孢子体外，还形成愈伤组织且随着培养基中蔗糖浓度的增加(0～3%)而增 多。温差(12h 15℃,12h 25℃)使以上形成的愈伤组织生长减慢，质地变硬，颜色变白；这些 愈伤组织能在 GA3 0.1mg·L-1 +1/2MS 大量元素+3%蔗糖的固体培养基中形成大量的胚状体 最终发育成大量的孢子体；对这些愈伤组织及其正在分化培养基中形成的胚状体进行组织