虾夷扇贝卵黄蛋白原基因克隆、表达及免疫功能研究.pdf

万方数据 谨以此论文献给我的恩师张士璀教授、我的家人和所 有关爱我的朋友们！ —— 吴 彪 万方数据 万方数据 万方数据 虾夷扇贝卵黄蛋白原基因克隆、表达和免疫功能研究 虾夷扇贝卵黄蛋白原基因克隆、表达和免疫功能研究 摘 要 卵黄蛋白原（Vitellogenin ）是几乎所有卵生动物卵黄蛋白的前体，是一种富 含磷、糖、脂的大分子蛋白。为人们熟知的是，卵黄蛋白原在卵母细胞中经蛋白 酶解成卵黄蛋白，为胚胎和幼体的生长提供主要的营养物质。然而，研究表明卵 黄蛋白原的生物学功能远不止于此。研究显示，鱼类卵黄蛋白原具有免疫功能， 能够参与免疫防御反应。但低等的海洋贝类卵黄蛋白原是否也具有免疫功能还不 清楚。虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis ）是我国重要的经济养殖贝类，近年来， 该产业面临着夏季成贝大面积死亡和幼虫培育前期可能发生的批量死亡的巨大 挑战。对于主要依靠非特异性免疫进行机体免疫防御的虾夷扇贝来说，挖掘新的 免疫因子，研究其免疫活性具有十分重要的理论价值和现实意义。为此，本论文 以虾夷扇贝为材料，主要进行了卵黄蛋白原基因克隆、表达、纯化及免疫活性的 研究，并初步探索了C 型凝集素母源免疫作用。 论文主要进行了虾夷扇贝卵黄蛋白原基因克隆、表达和免疫功能方面的研 究。首先，克隆获得了虾夷扇贝卵黄蛋白原基因 cDNA 全长，并研究了卵黄蛋 白原的时空表达模式以及对鳗弧菌（Vibrio anguillarum）刺激的响应规律；其次， 成功地运用原核表达系统对卵黄蛋白原的结构域DUF1943 和VWD 进行了体外 重组表达，研究了这两个结构域与细菌、病原相关分子模式 （Pathogen-associated molecular patterns ，PAMP ）脂多糖（LPS ）和脂磷壁酸（LTA ）的结合作用。最 后，我们从虾夷扇贝卵巢中分离纯化到了天然卵黄蛋白原蛋白并进行了抑菌实 验。 运用同源克隆策略和 cDNA 末端快速扩增（rapid-amplification of cDNA ends，RACE ）技术获得了虾夷扇贝卵黄蛋白原 （Py Vg ）基因全长cDNA 序列。 序列全长为7707 bp，开放阅读框（open reading frame，ORF ）的长度为6888 bp， 共编码2295 个氨基酸残基，其起始密码子为ATG ，终止密码子为TAA 。预测的 成熟蛋白分子量大小为265.14 kDa ，等电点为8.36。推断的氨基酸序列含有16 I 万方数据 虾夷扇贝卵黄蛋白原基因克隆、表达和免疫功能研究 个氨基酸残基的信号肽，存在一个类枯草杆菌的内切酶识别的裂解位点 R-X-R/K-R （本研究中为RDRR ），三个潜在的N-连接糖基化位点，以及在无脊 椎动物和脊椎动物中都比较保守的 “KTIGNAG ”基序（motif ）和“CGLC ”基 序。SMART 分析结果显示，Py Vg 的结构域包含Vitellogenin_N 、DUF1943 （domain of unknown function ）以及VWD （von Willebrand factor type D domain ），这三个 是卵黄蛋白原基因家族保守的结构域。Py Vg 氨基酸序列与栉孔扇贝 （Chlamys farreri ）和华贵栉孔扇贝（Mimachlamys nobilis ）等亲缘关系较近的海洋贝类相 似度较高，与其他昆虫、鱼类