实验三伪狂犬病抗体检测.pptVIP

实验四、伪狂犬病抗体检测（阻断ELISA);酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA);一、实验目的;二、实验原理;间接法（Indirect ELISA） 阻断法（Block ELISA) 双抗体夹心法（Sandwich ELISA) 竞争法（Competitive ELISA);（1）间接法测定抗体 A. 将抗原吸附于固相载体表面； B. 加抗体, 形成抗原-抗体复合物; C.?加酶标抗体； D. 加底物。测定底物的降解量＝抗体量。;显色; （2）阻断法测定抗体 A.?将抗原吸附在固相载体表面; B. 先加待检血清（抗体）, 形成抗原-抗体复合物; C.?再加酶标单抗； D. 加底物。;单抗;（3）双抗体夹心法测定抗原 A. 将抗体吸附于固相表面; B. 加待检抗原，形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体; E. 加底物。底物的降解量＝抗原量。 ; （4）竞争法测定抗原 A. 抗体吸附在固相载体表面; B. 同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。;酶标板，酶标仪 包被缓冲液：0.025M pH9.6碳酸盐缓冲液 猪伪狂犬病毒（PRV） —— 抗原 样品稀释液： pH7.4 PBS;阴性对照（EP管中，已稀释） 阳性对照（EP管中，已稀释） 样品 —— 待测猪血清（EP管中，已稀释） AP标记猪PRV单抗—— 酶标单抗（EP管中，已稀释） 洗涤液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS（青瓶）;常用酶及底物;底物缓冲液： pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液 底物溶液：TMB（四甲基联苯胺），底物缓冲液，30% H2O2，新鲜配制 终止液;1.抗原处理：;3.加待测血清：;取稀释好的被检血清2份和阴、阳性对照血清，每孔加入100μl，置37℃温育30分钟。 洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200μl，静置3分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复3次。 每孔加酶标单抗100μl，置37℃温育30分钟。 洗板：同步骤2。 显色与终止：每孔先加底物A液、再B液各1滴(50μl)，混匀，室温（18-25 ℃）避光显色10分钟后。 终止：每孔加终止液1滴(50μl) （0.25% 氢氟酸），终止反应。 10分钟内测定结果。采用波长630nm的酶标仪测定OD值。 结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均OD630值与阳性对照孔平均OD630值之差≥0.4。 S=样品??OD630值，N=阴性对照孔OD630值 如果S/N比值≤0.6，样品判定为PRV抗体阳性; 如果S/N比值≤0.7但 0.6，样品可疑; 如果S/N比值 0.7，样品判定为PRV抗体阴性。;五、结果与分析;预期结果;ELISA前血清样品37℃灭活30分钟。 在ELISA的整个操作过程中，洗涤是非常重要步骤，目的在于防止引起非特异性吸附，洗涤时尽可能除去未结合的抗原及杂质，用力甩干。 加入底物液后应室温避光，结果判断须在10分钟内。 实验中保持安定，不要随意走动、讨论不相关的事情。;思考题