细胞核分离纯化和核酸含量的测定2.PPTVIP

细胞核分离、纯化和核酸含量的测定 （二） 一、目的与要求 了解测定DNA和RNA含量的原理和方法。通过分别测定细胞质和细胞核中两类核酸的含量，了解DNA和RNA在细胞中的分布。 二、实验原理 RNA在碱性溶液中水解后，其核糖部分可脱水形成糠醛，后者能和苔黑酚（Orcinol, 3, 5-二羟基甲苯）缩合成绿色化合物，从而可以进行定量测定。 DNA在过氯酸溶液中加热水解后，其脱氧核糖部分可脱水生成ω-羟基-?-酮戊醛等化合物，然后再进一步与二苯胺作用，可产生蓝色化合物，其化学性质不明，但可用于定量测定DNA。 三、操作步骤 （一）RNA含量测定 碱水解：取离心管2支，编号。1号管加入细胞质和1mol/L KOH各1ml，2号管加入核液和1 mol/LKOH各1ml。分别混匀，置沸水浴中，10min，取出冷却。分别加0.3mol/L三氯乙酸4ml，搅匀，使DNA及蛋白质沉淀，3000r/min离心5min，上清液为RNA的碱水解液。 2. 显色及比色： 取试管3支，编号。按表10-1加入试剂立即混匀，置沸水浴中10min，取出冷却，在660nm波长处比色。以第3管作空白，读取光密度，查RNA标准曲线，获得细胞质和细胞核水解液中RNA的含量。 表中 RNA含量测定显色及比色时试剂加入方法 试剂（ml） 管 号 1 2 3 细胞质水解液 1.0 — — 核水解液 — 2.0 — 0.3 mol/L三氯乙酸 1.0 — 2.0 苔黑酚液 3.0 3.0 3.0 RNA标准曲线的制作： 标准曲线已作好,在墙上。 （二）DNA含量测定 酸水解：取离心管2支，编号。1号管加入细胞质和1mol/L过氯酸各2ml，2号管加入核液和1mol/L过氯酸各2ml。分别于95℃加热水解10min，倒出冷却，3000r/min离心5min，上清液为DNA水解液。 2. 显色及比色：取试管3支，编号，按表10-3加入试剂立即混匀，置沸水浴中加热12min，取出冷却后，在595nm波长处比色。以第3管作空白，读取光密度，查DNA标准曲线，即获得细胞质和细胞核水解液中DNA的含量。 RNA含量测定显色及比色时试剂加入方法 试剂（ml） 管 号 1 2 3 细胞质水解液 2.0 — — 核水解液 — 2.0 — 0.5 mol/L过氯酸 — — 2.0 二苯胺试剂 2.0 3.0 2.0 3. DNA标准曲线的制作： 标准曲线在墙上。 四、结果与计算 1. 样品中RNA含量（?g/mL）=碱水解液中RNA含量（?g/管）?稀释倍数（细胞质稀释6倍，核液稀释3倍）。 2. 样品中DNA含量（mg/ml）=酸水解液中DNA含量（mg/管）?稀释倍数（细胞质与核液均稀释2倍）?细胞质与核液的实际用量（均为2ml） 3. 分别计算出细胞质和细胞核中RNA：DNA的比值。 五、应用意义 利用此法可对细胞中的遗传物质RNA或DNA作定量测定，从而为临床上一些有关核酸的分离测定技术提供一种必要的补充手段。 六、注意事项 (一) RNA和DNA分别用碱和酸水解及离心后，吸取上清液时要尽量避免将沉淀吸入，否则会引起结果的误差。 (二) 在计算样品中RNA和DNA含量时，要注意样品的稀释倍数。 (三) 在比色时，要注意用于RNA和DNA的波长是不同的。 是非题 RNA都存在于细胞浆中。 （NO） RNA在过氯酸溶液中加热水解后，其核糖部分可脱水形成糠醛。 （NO） 在DNA双链结构中，碱基位于内侧，两条链的碱基之间以氢键相接触。 （YES） 单选题 1.——可用于测定DNA的浓度。（B） A.OD280 B.OD260 C. OD240 D.OD220 2. Tm值与DNA的分子大小和所含碱基中的————比例成正比。 （D） A.A+T B.T+C C. A+G D. G+C 3. hnRNA即核内不均一RNA。是指在真核细胞核内合成的————初级产物。 （A） A. mRNA B.tRNA C.rRNA D.miRNA * 今天，我们上综合实验中的第二部分，细胞核中核酸含量的测定 * 一、目的与要求 了解测定DNA和RNA含量的原理和方法。通过分别测定细胞质和细胞核中两类核酸的含量，了解DNA和RNA在细胞中的分布。 * 二、实验原理 RNA在碱性溶液中水解后，其核糖部分可脱水形成糠醛，后者能和苔黑酚（Orcinol, 3, 5-二羟基甲苯）缩合成绿色化合物，从而可以进行定量测定。 DNA在过氯酸溶液中加热水解后，其脱氧核糖部分可脱水生成ω-羟基-?-酮戊醛等化合物，然后再进一步与二苯胺作用，可产生蓝色化合物，其化学性质不明，但可用于定量测定DNA。 * 三、操作步骤