伯氏疟原虫哌喹抗性系小鼠病理学特征与抗性相关性研究.docVIP

　　伯氏疟原虫哌喹抗性系小鼠病理学特征与抗性相关性研究 --1材料与方法 1.1材料 疟原虫感染导致死亡的主要原因是脑型疟并发多器官功能障碍综合征,脑型疟的发病机制与机械阻塞及免疫病理相关,疟原虫感染并在脑部粘附,诱导宿主抗感染的免疫细胞迁移至脑部并被激活,免疫细胞又促进原虫在脑部粘附,最终使宿主脑部受到机械和免疫病理双重损伤而发生脑型疟,聚集到脑部的pRBC数量及原虫的侵袭力是脑型疟发生的关键因素#65377; 1.1.1 PbPQS和PbPQR PbPQS系由海南省热带病重点实验室惠赠,以低温冷冻和鼠间血传交替保种;PbPQR系由海南医学院科学实验中心建立及保种#65377; 1.1.2实验动物及分组 80只雄性瑞士种昆明远交系小鼠购自广州中山大学实验动物中心,6~8周龄,体重为(25±2)g#65377;随机分为3组,即A组(PQS组)10只#65380;B组(PQR组)和C组(正常对照组,NC)各35只#65377; 1.1.3试剂吉姆萨( Giemsa)粉剂购自国药集团化学有限公司,苏木素(Hematoxylin)#65380;伊红(Eosin)购自阿拉丁试剂公司#65377; 1.2方法 1.2.1实验动物感染 A#65380;B组分别腹腔感染PQS系和PQR系1×107个红内期原虫(200μL血),C组腹腔注射200μL生理盐水#65377;A组小鼠在感染后3#65380;6d,B#65380;C组小鼠在感染后3,6,9,12,15,17及22d脱颈处死,取肝#65380;脾#65380;脑和肾组织制片#65377; 1.2.2染液配制 HE染液采用改良Carazzi苏木素染液配制法配制#65377;Giemsa染液原液根据文献配制后,用pH6.8的磷酸盐缓冲液30倍稀释后做为组织切片染色液#65377; 1.2.3 HE染色方法小鼠肝#65380;脾#65380;脑及肾组织经石蜡包埋后4μm切片,60℃烤箱30min,二甲苯中脱蜡,梯度乙醇水化,苏木素染液中5min,水冲洗,1%盐酸乙醇中分化3s,水冲洗,pH7.2 PBS中返蓝30s,水冲洗,1%伊红中染色20s,水冲洗,梯度乙醇脱水,二甲苯中透明,中性树胶封固后镜检#65377; 1.2.4 Giemsa染色方法组织切片的Giemsa染色脱蜡#65380;水化过程与HE染色同,其染色为30倍稀释染液室温染色5min,水冲洗,水溶性封片剂封固后镜检#65377; 1.2.5分析方法 采用半定量的方法对pRBC#65380;HZ及炎性细胞的组织中浸润程度进行分析判断,每个标本随机选择5个高倍(×400)及油镜(×1 000)视野观察分析,每组取5个标本的均数作为该组的半定量结果#65377; 2结果 2.1感染小鼠一般情况 PQS组小鼠感染6d时均出现体重下降,精神萎靡#65380;缩头不动,皮毛松弛#65380;尾巴发青触及无热度#65380;对外界刺激反应下降等濒死症状;PQR组小鼠感染6d未见明显变化,仅个别鼠在感染17d后出现上述症状#65377; 2.2正常对照组组织HE及Giemsa染色镜检 正常对照小鼠(C组)肝#65380;脾#65380;脑及肾组织光学显微镜下结构正常,组织细胞轮廓清晰完整,见图1A#65380;图2A#65380;图3A#65380;图4A#65377; 2.3PQS和PQR组肝脏组织HE及Giemsa染色镜检 PQS组3d时可见肝窦轻度充血,肝细胞水肿,局部呈颗粒或气球样变性,肝窦及汇管区可见明显的中性#65380;淋巴#65380;单核等炎性细胞浸润,个别成团分布,枯否氏细胞增生,可见个别位于红细胞内的疟原虫(Parasitised Red Blood Cell,pRBC)及疟色素(MalariaPigment Hemozoin,HZ)颗粒#65377;6d时肝细胞变性#65380;肝窦充血加重,以淋巴细胞#65380;单核细胞为主的炎性细胞大量增加,肝窦内可见大量的pRBC及呈点状或团块状分布的HZ,枯否氏细胞数量明显增多,体积增大,大量细胞胞浆内吞噬有疟原虫#65380;大小不等的HZ颗粒及红细胞碎片;PQR组肝窦及汇管区的中性#65380;淋巴#65380;单核以及枯否氏细胞浸润从3d时开始逐渐增加,感染第6#65380;9d时,炎性细胞以淋巴及单核细胞增加为主,少量中性粒细胞,偶见个别pRBC;9d开始可见局部肝组织充血,并逐渐加重,个别肝细胞结构疏松,体积增大,水肿变性;12d时其汇管区及肝小叶边缘区炎性细胞浸润更为明显,单核细胞比例进一步增加,个别样本的部分肝小叶结构破坏,pRBC或疟原虫及HZ增加,部分聚集成团,枯否氏细胞对其吞噬活跃;17d时以上变化达到高峰,22d时炎性反应#65380;pRBC及HZ明