6-质粒DNA的提取和鉴定.pptVIP

综合性设计性实验-6;此实验共包括如下三个部分 第一部分，质粒载体的选择以及所插入的外源DNA片段序列生物信息学分析部分 第二部分，质粒DNA的提取与鉴定实验操作部分 第三部分，真核表达载体和RNA干扰载体的使用;第一部分，质粒载体的选择以及所插入的外源DNA片段序列的生物信息学分析;质粒的基本知识;质粒有筛选标记，能提示质粒是否进入宿主细胞，可明显地区别于其它细胞，筛选标记可为抗生素抗性基因或营养缺陷型基因，这样能改变宿主细胞的耐药性，使宿主细胞在含抗菌素环境中生存，或宿主细胞在缺乏某种营养组分时候还能生存。 质粒含有启动子序列，能够自我复制。不过质粒的复制和转录都依赖于宿主编码的蛋白和酶，或能在胞质中进行自我复制，或整合到细胞染色体中作为细胞遗传物质的一部分随染色体一起复制。 质粒的特点使其成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。;质粒DNA能从细菌中提出来，又能再转入细菌，这个过程称转化。 转入的质粒DNA仍能进行复制，产生多个拷贝。;5‘AOX1 启动子片段含有AOX1启动子，在甲醇的诱导下可启动外源蛋白的表达； α-因子信号肽序列为约89个氨基酸的信号肽序列，能使外源蛋白分泌到发酵上清中，更利于外源蛋白的纯化； 多克隆位点含多个酶切位点，为外源基因的插入提供位点； TT序列提供有效的转录终止和polyA修饰信号； HIS4为营养缺陷型筛选标志； 3‘AOX1 基因片段能够与基因组AOX1基因属同源重组； 抗Amp 基因和pBR322能使空载体和构建的表达载体在 E.coli 中筛选和复制。;根据实验的需要是否将片段进行表达，将载体分为表达载体和克隆载体。 克隆载体一般是将需要目的DNA片段与载体相连接，导入原核细菌内，使质粒在原核细菌内大量复制，得到大量的重组质粒。 常用的克隆载体有： pGEM-T, pBR322, pUC18/19 表达载体一般是将需要目的DNA片段与载体相连接，导入原核细菌或真核细胞内，使目的DNA片段在菌内或细胞内得到转录与翻译，得到目的蛋白。 常用的表达载体： 原核系统：pET系列，pQE系列，pGEX系列 酵母表达系统：pPIC9，pPIC9k，pPICZ 真核细胞系统：pCMVp-NEO-BAN，pEGFP， CMV4，pEGFT-Actin ;序列的查询与获得;输入基因名称 选择查询项目 点击“Go”;注意选择人属物种的基因;蛋白质序列;挪摧旧毫肘辈蹈灸儡坤鳞篇厚源赞粹挖驴汹所指甄难好顺绢蒋肾取垦磨两6-质粒DNA的提取和鉴定6-质粒DNA的提取和鉴定;运行DNAstar软件;点击“OK”;密码子使用分析 http://www.kazusa.or.jp/codon/countcodon.html ;启动子区的分析 ;CpG岛分析;实验目的 掌握碱裂解法提取质粒的方法 了解质粒酶切鉴定原理;方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法；酸酚法等。碱裂 解法有操作简便、快速、得率高的优点。 概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求。 ;碱裂解法基本原理;在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子：一般来说，其中闭环结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是单链开环。 溴化乙锭(EB)是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。;限制性内切酶（restriction endonuclease）指能识别碱基构成特异的一段（4~8 bp）双链核酸序列，并从中将核酸的磷酸二酯键断裂的一种蛋白酶。 每种酶有特异的识别核酸序列，称为酶切位点，