可调控性upa诱导表达系统的构建及功能鉴定-中国试验动物学报.docVIP

可调控性uPA诱导表达系统的构建及功能鉴定 陈丽香1，周晓静3，刘文文4， 周文江1，任晓楠1，于士颜1， 周晓辉1,2 （1.上海市公共卫生临床中心，上海，201508；2.复旦大学医学分子病毒学教育部卫生部重点实验室，上海，200032；3.蚌埠医学院第一附属医院，安徽蚌埠，233004；4.赤峰学院附属医院，内蒙古赤峰，024000） [摘要] 目的 构建可调控性尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator；uPA）诱导表达系统并进行相关鉴定，可为进一步构建可诱导型肝脏人源化uPA-SCID动物模型奠定基础。方法 可调控性uPA诱导表达系统即在强力霉素（doxycycline；Dox）诱导下通过tet-on系统调控uPA表达。为此，需要构建两个重组质粒，分别为pLNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rtTA和pLNHXO5O6-TRE2-uPA-IRES-ZsGreen，前者引入Gaussia荧光素酶（Gaussia enzyme fluorescent element, Gluc）与四环素反式激活因子（reverse tetracycline transactivator;rtTA）偶联表达，以便于监测rtTA表达水平；后者同时偶联表达ZsGreen，以便于用荧光显微镜观察基因表达。重组逆转录病毒载体进行表达功能鉴定后，将构建质粒与病毒包装衣壳蛋白VSV-G质粒共转染GP2-293包装细胞系后获得具有感染能力的病毒颗粒，利用该病毒感染NIH/3T3细胞，并用G418筛选出阳性细胞；期间各取部分细胞，使用PCR方法鉴定其基因组内是否含有相应基因转录调控本。结果 成功构建pLNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rtTA和pLNHXO5O6-TRE2-uPA-IRES-ZsGreen克隆。功能鉴定显示，pLNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rtTA克隆可表达rtTA；pLNHXO5O6-TRE2-uPA-IRES-ZsGreen克隆转染HepG-Tet-on细胞，加Dox可诱导uPA表达。包装病毒感染NIH/3T3细胞后通过G418筛选获得单细胞克隆，通过PCR方法鉴定表明其基因组内含有相应转录本,从而成功构建uPA诱导表达稳定细胞株。结论 本研究初步建立了可调控性uPA诱导表达系统，从而为可诱导肝损的uPA-SCID转基因小鼠的构建及在此基础上的肝脏人源化动物模型的建立奠定了基础。 [关键词] 可调控肝脏损伤；Alb；uPA；肝脏人源化小鼠 [中图分类号] Q95-33 [文献标志码] A The establishment of the uPA inducible expression system CHEN Li-xiang1,ZHOU Xiao-jing3,LIU Wen-wen4,ZHOU Wen-jiang1,REN Xiao-nan1, YU Shi-yan1,ZHOU Xiao-hui1,2 （1.Shanghai Public Health Clinical Center Affiliated to Fudan University,Shanghai,201508,China;2.Key Laboratory of Medical Molecular Virology,Ministry of Education and Health,Shanghai Medical College,Fudan University,Shanghai,200032,China;3.The first affiliated hospital of bengbu medical college,bengbu,233004,China;4.Affiliated hospital of Chifeng University,Chifeng,024000,China） [Abstract] Objective To establish uPA inducible expression system using recombinant retroviral system for the further construction of inducible uPA-SCID animal model. Methods The Inducible expression system need to construct two plasmids:pLNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A -rtTA and pLNHXO5O6-TRE2-uPA-IRES-ZsGreen respectively.Both plasmids wer