飞行质谱仪检测样品的详细操作步骤.pptVIP

质谱专家建议：跑胶、切胶、酶切、除盐等操作过程中，尽量戴上手套、口罩、头帽等，并选用较好的实验材料；不要使用不挥发性盐，挥发性盐含量控制在20mM以下，最好做 Ziptip 除盐处理。 * * MALDI-TOF检测样品 详细操作过程 仪器名称： 基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪（简称 MALDI-TOF） 仪器外观 1. 对生物大分子分子量的测定；2. 对蛋白质进行高通量的鉴定(高纯度单一蛋白）；3. 对有机小分子化合物分子量的测定；4. 对寡核苷酸的分析；5. 对基因的单核苷酸多态性的分析。广泛应用于蛋白质组学、基因组学、分子生物学研究领域。 主要功能与应用 型号：autoflex 1、 线性模式飞行距离：1.22米；反射模式飞行距离：2.7米2、 质量范围：可高达300,000道尔顿或更高3、 分辨率： 线性模式：ACTH18-39(m/z=2465.2)，激光打30次，分辨率4,000 反射模式：Somatostatin (m/z=3147),，激光打30次，分辨率20,000 4、 灵敏度：1fmol ACTH18-39(m/z=2465.2)，激光打20次 线性模式 信噪比大于10：1； 反射模式 信噪比大于10：1 5、 质量准确度： 线性模式 质量准确度≤ 250 ppm。 反射模式 质量准确度≤ 60 ppm。 主要性能指标 （一）准备基质溶液（Matrix preparation protocol） （说明：根据样品类型选用合适的基质，此处的HCCA适于肽类和小分子蛋白） Produce a saturated solution of HCCA in (acetonitrile : 0.1%TFA, 1 : 2 v/v) Mix solution in ultra sonic device Spin down excess matrix in a centrifuge (5 min at 14000 RpM) and use the clear supernatant 一、样品制备 （二） 手动点靶（Preparation onto MALDI TOF-Target） 干点法（Dried droplet method）：最为常用的一种方法 Mix equal volumes of sample with HCCA Apply 1ul onto the target 按图示模式点靶 Dry at room temperature 标 样 样 样 样 样 样 样 样 标 样 样 样 样 样 样 样 样 “自动点靶设备 样品 “靶”（ MALDI TOF-Target） 四、谱图解析 蛋白鉴定样品：进入下一步网上数据库检索 下面介绍： “肽指纹谱”网上数据库检索 两种方法： 一、登陆mascot网站，直接调用.peaklist文件，进行检索。 二、用biotools软件，打开样品的原始谱图，设定参数，重新 标峰，自动链接mascot网页，进行检索。将检索到的结果与原始谱图比对，检查峰匹配情况。此法可以省略步骤（三、标峰） 登陆网站点击 第一种方法 设定各参数 调用 .peaklist 文件 点击开始 网上数据库检索结果 分值76的区域 根据样品来源确定目标蛋白 点击选中的蛋白链接，则显示氨基酸序列等详细信息 蛋白序列信息 理论与检测值比较 检索结果 选中目标蛋白后，点击get hit(s) 可通过谱图，直观地查看峰的匹配情况 Get hit(s)后显示的页面 五、校准样品谱图 校准样品有四种： 1、peptide calibration standard (~1000Da - ~4000Da) 简写为：pep_cal 2、protein calibration standard (~3000Da - ~25000Da) 简写为：pro Ⅰ _cal 3、protein calibration standard Ⅱ (~20000Da - ~70000Da) 简写为：pro Ⅱ _cal 4、oligonucleotide calibration standard (~3000Da - ~10000Da) 简写为：oligo_cal pep_cal的谱图 pro Ⅰ _cal的谱图 pro Ⅱ _cal的谱图 oligo_cal的谱图 以下几张谱图供大家参考。 六、举例 肽谱干净无杂质，清晰易准确标峰，检索结果得分值高 肽谱干净无杂质，清