107第七章 外源基因表达系统60张幻灯片1.ppt

* * 从2000年以后，哺乳动物细胞表达系统更受重视。目前，美国418种在研药物中约70%是以哺乳动物细胞表达的。在FDA已批准上市的生物技术药物中，哺乳动物细胞表达的产品占70%以上。 * * 一.用于哺乳动物细胞表达的载体 病毒载体： （1）含有能够被真核细胞识别的有效启 动子 （2）在感染周期中能够持续复制，达到很 高的拷贝数。 （3）控制自己复制的元件 （4）有些载体可高效稳定地整合到寄主基 因组上 （5）外壳蛋白识别细胞受体，可将外源基 因高效导入受体细胞。 * * 1.SV40病毒载体 SV40：猿猴空泡病毒（Simian vacuolating virus 40, SV40) 环型双链DNA分子，含5243bp。 * * 重组的病毒-质粒载体 含有完整的早期区段和复制起点的病毒-质粒载体： 病毒的早期区段和复制起点+大肠杆菌的质粒分子重组而成。 例如：p?C10＝早期区段和复制起点（多瘤病毒）＋质粒pBR322 这种载体既可在大肠杆菌中复制，也可在哺乳动物细胞中复制，称之为穿梭载体。 * * 2.反转录病毒载体 宿主范围广，感染动物或人的细胞。 具有强启动子 不引起宿主细胞的死亡，可以维持许多代 * * 第四节 外源基因导入宿主细胞的物理化学方法参见教材第六章P121页 * * 1.磷酸钙沉淀法转染技术 1973年F.L.Graham等人建立 通过形成一种DNA-磷酸钙沉淀物，使之黏附到培养的哺乳动物单层细胞表面，就会迅速地被细胞捕获 能将任何外源基因有效地导入培养的哺乳动物细胞 * * DNA+CaCl2 混匀 Hepes-磷酸盐溶液中 DNA-磷酸钙沉淀 沉淀吸附到细胞上共同孵育 换培养液 筛选，10%的细胞转入了外源DNA 搅拌中逐滴加入到 * * 2.DEAE-葡聚糖转染技术 DEAE-葡聚糖是一种高分子量的多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源的DNA DEAE-葡聚糖与DNA形成复合物免受核酸酶的降解，与膜发生作用，使DNA穿过细胞膜 方法简单、重复性高、特别适用于研究基因瞬时表达，转染效率高于磷酸钙转染法 * * 3 .电穿孔DNA转移技术 1982年T.K.Wang and E.Neumann 建立 在高压脉冲的作用下使细胞膜上出现微小的孔洞，从而导致细胞外界环境中的DNA 穿孔而入 操作简便、转染效率高，适用于各种细胞。 可转移大于100Kb的质粒DNA。 * * Cell + DNA 0oC 2~4KV，10min（脉冲） 换培养液 筛选 * * 4.脂质体载体法 外层是脂质双分子层，内含水溶液，包括DNA分子 * * 脂质体载体法： 将DNA包装在脂质体内部，通过脂质体的双层膜同受体细胞膜之间的融合作用，使外源基因进入细胞质、细胞核。 * * DNA-脂质体复合物法： 外源DNA与阳离子脂质体通过两者之间的静电引力结合在一起形成DNA-脂质体复合物，并且阳离子脂质体与表面为负电荷的受体细胞发生强烈的作用，导致脂质体与细胞膜之间发生融合作用，使DNA-脂质体复合物进入细胞。 * * 基因显微注射技术 应用显微注射器，把重组的DNA 直接注射到受体细胞质或细胞核。 * * 基因枪转化技术 ◆通过高压气体（氦气、氮气）等动力，高速发射包裹有重组DNA的金属颗粒，将目的基因直接导入受体细胞，并整合到染色体上的方法。 ◆此法已广泛用于转化水稻、小麦、玉米、大豆等主要作物。 * 参见张惠展著《基因工程》第207页 信号假说：分泌型蛋白质的定向输送，就是靠信号肽与胞浆中的信号肽识别粒子（SRP）识别并特异结合，然后再通过SRP与膜上的对接蛋白（DP， 即SRP受体）结合后→开放膜蛋白通道→分泌性蛋白穿过膜→膜外侧面信号肽酶切断信号肽加工区。 信号肽的一级结构 * * 优点： 酶解作用低 纯化方便 增进蛋白折叠 N-端的结构真实 * * 分泌表达形式的缺点： 相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因即便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多。 * * 短小芽孢杆菌表达蛋白质 例1：表达白细胞介素－2，表达产物无需复性处理，即具有生物活性。产率达50mg/L。 例2：表达人表皮生长因子（EGF），产率达1g/L以上。 澳大利亚盛产羊毛，每年需要大批的剪羊毛的技工，由于EGF可引起羊毛从根部自行脱落，故每只羊注射5mgEGF，在1月后可用手直接抓下羊毛。 * * 利用梭菌属嗜热菌株由纤维素生产乙醇 纤维素是由葡萄糖单体以β－1，4－糖苷键连接的多糖，利用梭菌属嗜热菌株可由纤维素直接发酵生产乙醇。利用