基因工程--人的重组肿瘤坏死因子的生产.doc

人的重组肿瘤坏死因子的生产 肿瘤坏死因子-α( Tumornecrosisfactor, TNF -α)是由激活的巨噬细胞所产生的一种内源性调节因子 ,属一种多功能蛋白质分子 ,在机体内起着重要的生理作用。它不仅可作为宿主防御、 免疫以及内环境稳定等生理过程的介质 ,还是感染、 炎症及损伤的病理因子。其对多种肿瘤细胞具有直接杀伤作用 ,并可显著提高机体对外部刺激的抵抗力。但由于有一定的毒副作用 ,其临床疗效并不令人十分满意。为了使 TNF-α发挥其独特的抗肿瘤作用 ,降低毒性 ,成为治疗癌症的重要药物 ,国内外科学家通过基因工程手段对天然 TNF分子进行改造 ,如从N末端缺失 7 个氨基酸,将 Pro8-Ser9-Asp10换成 Arg –Lys-Arg,将 C 末端 157 位的 Leu 换成 Phe等。随着基因重组技术的进步，对改变人TNF蛋白质氨基酸序列进行了研究，通过人工合成DNA进行克隆，培养大肠杆菌生产氨基酸序列发生局部变化的新TNF变种。实验证明，这些新TNF变种的体内抗肿瘤作用比人TNF强，而且副作用小。 其包括的步骤如下： 人TNF表达质粒的制备 1.1质粒DNA的提取 按碱裂解法进行天然TNF-α的表达质粒PUX66 TNFDNA 以及 PUC18、 PBV221质粒 DNA的提取。 1.2 PCR引物的设计与合成 根据对天然 TNF-α分子结构中 N 末端和 C末端氨基酸分子结构与生物学活性的研究设计引物。 1.3聚合酶链式反应(PCR) 以天然 TNF -α质粒 PUX66TNF-αDNA为模板，用上述合成的 PCR引物在热循环仪上进行扩增反应。反应程序为:首轮循环 ,94 ℃5min,50 ℃1min，72 ℃1min;后续循环 ,94 ℃1min，50 ℃1min,72 ℃10min。扩增后产物即为 TNF -α突变体DNA 1.4表达质粒的构建 将 PCR扩增产物 TNF-α突变体 DNA经 Klenow酶补平 ,再用 EcoRI 酶切。取提纯的 PUC18质粒 DNA经BamHI 酶切、 Klenow酶补平后 ,再用 EcoRI 酶切。上述酶消化的 DNA均为粘2平末端 ,将它们混合后用 T4DNALigease 酶连接成环状重组 DNA。取培养好的E.Coli JM109制备感受态细胞 ，加入连接反应后的环状重组DNA,进行转化。 2.构建工程菌 2.1宿主细胞感受态细胞制备 2.2重组质粒转染、转化 2.3具有目的基因的细胞的筛选 3.目的基因的诱导表达 将40μl 重组菌液接种到 20mlLB 液体培养基中 (含氨苄青霉素)，30℃振荡培养过夜 ,再将 20ml 菌液接入100mlLB 培养基中(含氨苄青霉素) ，30 ℃振摇 5h，达2～4× 108菌/ml, 迅速升温 42℃,振摇 6h,6000r/min离心10min, 收集菌体。用20ml 缓冲液 I(20mmol/LTris-HCl，pH8.0，5mmol/LEDTA )悬浮菌体 ,用 200W超声波破碎5min，10000r /min离心10min，上清为粗制TNF-α突变体蛋白。 载体的提纯 目的基因的获得 重组载体的构建（酶切、连接） 宿主细胞的培养 宿主细胞的转化、转染 转化转染细胞的筛选 目的基因的表达 图：重组肿瘤坏死因子的生产流程