鄄鄄着蛋白磷酸化修饰的生物质谱分析-北京大学医药卫生分析.PDF

第4 1 卷 分析化学 (FENXI HUAXUE )摇 研究报告 第11 期 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2013 年11 月 Chinese Journal of Analytical Chemistry 1653 ~1658 DOI:10.3724/ SP.J.1096.2013.30533 14鄄3鄄3着蛋白磷酸化修饰的生物质谱分析 1 2 3 *3 李子健摇 何 鑫摇 潘晨宇摇 刘 宁 1(北京大学第三医院血管医学研究所,卫生部心血管分子生物学与调节肽重点实验室, 分子心血管学教育部重点实验室,心血管受体研究北京市重点实验室,北京 100021) 2 3 (吉林大学化学学院,长春 130021)摇 摇 (吉林大学第二医院,长春 130041) 摘摇 要摇 本研究在HEK293细胞中过表达带有6个组氨酸标签的14鄄3鄄3着蛋白,经镍离子亲和树脂富集和凝 胶电泳等生物化学方法分离并富集目标 14鄄3鄄3着 蛋白。 利用特异性胰蛋白酶对 14鄄3鄄3着 蛋白进行胶内水解 后,采用TiO 亲和层析法,对蛋白水解混合物中的磷酸化修饰肽段进行富集,并利用生物质谱技术分析鉴定 2 了14鄄3鄄3着蛋白中的磷酸化修饰位点。 结果表明,利用生物质谱技术,结合人工解谱的方法,能够高效、准确 地鉴定HEK293细胞中过表达的14鄄3鄄3着蛋白中的磷酸化修饰肽段的结构信息,确定了14鄄3鄄3着蛋白中的12 个磷酸化修饰位点,其中多个位点的磷酸化修饰为首次发现。 关键词摇 质谱;14鄄3鄄3着蛋白;磷酸化修饰 1摇 引摇 言 14鄄3鄄3蛋白是Moore等于20世纪60年代在研究脑蛋白质系统分类时发现的,根据这类蛋白质在 [1] DEAE 纤维素膜层析中的片段数以及它在淀粉凝胶电泳上的迁移位置而命名 。 14鄄3鄄3 蛋白为酸性蛋 白质,分子量约28~33 kDa,pI4 ~5。 在哺乳动物中存在7 种异构体(茁,着,酌,浊,滓,子,灼;原命名的 琢和啄 实际是茁 和灼 的磷酸化形式),主要以同源/ 异源二聚体形式存在。 14鄄3鄄3蛋白是广泛表达的蛋 白家族,主要存在于神经组织内,在心、肝、肾、小肠和睾丸等几乎所有组织中表达。 14鄄3鄄3蛋白的主要 功能是作为接头蛋白与其它蛋白质结合,进而通过多种机制调节它们的生物学功能[2~7]。 有证据显示, 14鄄3鄄3蛋白的许多重要的生物学功能是通过其本身的磷酸化修饰来介导、调节和完成的。 例如,鞘氨醇 [8] 依赖性蛋白激酶1(SDK1)可使14鄄3鄄3蛋白发生磷酸化修饰,进而调节细胞信号转导 。 PKC灼 激酶能 [9] 够磷酸化14鄄3鄄3茁,磷酸化的14鄄3鄄3茁 进而负调控PKC灼 和 Raf鄄1相互作用,调节细胞信号转导 。 PKC啄 [7] 激酶能够磷酸化14鄄3鄄3灼,从而诱导神经细胞凋亡,调控癫痫疾病的发生发展 。 关于14鄄3鄄3蛋白翻译 后修饰(特别是磷酸化修饰)的种类和位点的研究鲜有报道。 因此,研究 14鄄3鄄3蛋白的