PromegaGoScript反转录系统快速操作方法.PDF

Promega GoScript 反转录系统快速操作方法 适用于GoScript 反转录系统（A5000 、A5001 ）或GoScript 逆转录酶（A5003 、A5004 ）的快速操作程序 本操作方法提供了对RNA 进行 15 minutes 快速反转录的实验步骤，得到的cDNA 用于Real Time PCR 定量，完成全部操作仅需三步，具有操作简单快速的优点。 对于经验丰富的实验者，反转录系统的各组分独立，方便调整用量以优化反转录条件。详细的优化方法 请参阅GoScript 反转录系统的完整操作手册TM316：/tbs/tm316/tm316.pdf 。 GoScript 反转录系统（A5000、A5001 ）包含进行反转录所需的所有组分。采用 A5000/A5001 ，按以下 步骤进行，可快速完成RNA 的反转录： 第一步，将GoScript 反转录系统中各组分取出置于冰上融化后，按下表加入各组分，配制RT-Mix （按 总反应体积20 μl 计算；通常配制RT-Mix 要比实际样品数多1-2 个，以防止液体挂壁造成的体积损失）： 组分 每反应加入量 乘以样品个数 个 Nuclease-Free Water 0.6 μl μl GoScript™ 5X Reaction Buffer 4 μl μl MgCl2 (25 mM) 4 μl μl Oligo(dT)15 Primer (500 μg/ml) 0.5 μl μl Random Primers (500 μg/ml) 0.5 μl μl PCR Nucleotide Mix 1 μl μl Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor 0.4 μl μl GoScript™ Reverse Transcriptase 1 μl μl 总体积 12 μl μl 第二步，将配好的RT-Mix 分至各反应管，加入总RNA （1-2 μg），并加水将体积补齐至20 μl： 组分 加入量 RT-Mix 12 μl RNA (1-2 μg) μl Nuclease-Free Water μl 总体积 20 μl 第三步，设置以下程序进行反转录反应，包括 42 ℃、15min 的延伸和70℃、15min 的反转录酶灭活： 反转录程序完成后得到的cDNA 可直接用于Real Time PCR 定量，或储存于-20 ℃备用。进行后续Real Time PCR 定量实验时， cDNA 的用量建议不超过总反应体积的1/5。 本简化程序来源于实验经验，合成得到的 cDNA 仅适用于 Real Time PCR 定量。如果需要进行基因克隆等其他实验或进行 Real Time PCR 实验后目的基因的Ct 值大于30，建议采用GoScr