热疗对顺铂耐药卵巢癌化疗增敏作用体外实验探究.doc

热疗对顺铂耐药卵巢癌化疗增敏作用体外实验探究摘 要：目的：热疗是一种古老的疗法，热疗除了能够直接杀伤癌细胞外，还具有放射增敏和化疗增敏作用。本实验研究的目的旨在探讨热疗与顺铂联合对人卵巢癌顺铂耐药细胞株 CAOV3/cDDP的生长抑制作用以及温度与药效的关系。方法：将热疗(42℃)和顺铂(6、12、24μg/mL)分别单独以及联合作用于体外培养的人卵巢癌CAOV3/cDDP细胞株。采用MTT(methyl thiazolyl tetrazolium)法检测各实验组人卵巢癌耐药细胞株CAOV3/cDDP的生长抑制率；采用集落形成实验观察各实验组对人卵巢癌耐药细胞株CAOV3/cDDP的诱导分化作用；应用光镜观察实验处理前后人卵巢癌CAOV3/cDDP细胞形态和结构的变化，确定凋亡细胞，评价各组细胞凋亡程度。结果：42℃热疗单独作用对肿瘤细胞的生长仅有轻度抑制作用，但它能显著增强顺铂对肿瘤细胞的抑制效应。受热42℃的顺铂与37℃生理温度下的顺铂相比较，前者对体外培养的肿瘤细胞有明显的杀伤作用(P50个细胞的克隆数。取3个复孔均值，按下式计算集落形成率。 集落形成率(%)=(实验组集落均数/空白对照组集落均数)×100% 3.4 细胞形态学观察 3.4.1相差显微镜观察 经上述处理后，相差显微镜下动态观察，接种于盖玻片上的对照组和各实验组细胞的形态变化。 3.4.2光学显微镜观察 经上述处理及动态观察后，将培养皿中的盖玻片捞出，PBS液漂洗2次，95%酒精室温固定20～30min，0.05%瑞氏-吉姆萨染色15～30min，冲洗凉干，二甲苯透明后，直接反转，放于洁净载玻片上，树胶封片。光镜下观察，确定凋亡细胞。 3.5 数据处理 采用F检验，t检验，SPSS11.0统计软件包进行统计分析。 4 结 果 4.1 卵巢癌CAOV3/cDDP细胞生长抑制率 MTT法测定化疗组、热化疗组细胞生长抑制率结果见表2。 4.2 药物联合作用结果 计算热疗与顺铂相互作用指数(CDI)值，热疗与各浓度顺铂联合作用于卵巢癌CAOV3/cDDP细胞60min，CDI0.7，说明42℃热疗对顺铂具有非常显著的协同增敏作用。详见表3。 4.3 卵巢癌CAOV3/CDDP细胞集落形成率 实验组较对照组相比集落生长特性明显降低，细胞呈单个生长状态，且单个集落中细胞数显著少于对照组。热化疗组细胞集落形成率较单独化疗组明显降低(P0.01)，说明热疗对化疗具有显著增敏作用。此实验结果同MTT检测的结果相一致。 4.4细胞形态学变化 相差显微镜动态观察了对照组和各实验组细胞形态的变化，根据上述药物作用效应分级标准，评价各实验组药物作用等级，详见表4。观察发现药物作用强度在一定范围内呈现对浓度、温度和时间的正相关性。各实验处理对人卵巢癌CAOV3/cDDP的作用主要表现在对卵巢癌细胞贴壁能力的影响和细胞大小、形态的变化。药物作用等级不同，对卵巢癌CAOV3/cDDP细胞的影响也不同：药物作用效应在3～4度之间的各实验组，给药12h细胞就出现体积缩小、皱缩、不规则分裂、胞膜出泡现象，细胞贴壁能力明显下降，许多细胞脱落呈漂浮生长状态，随作用时间延长，脱落细胞逐渐增多，至24h时约70%～80%的细胞呈悬浮生长；作用效应在2～3度之间的各实验组，药物作用后，细胞逐渐变圆、变粗糙、折光性减弱，24h这种现象更明显，同时有部分细胞鼓泡、漂浮；作用效应在1～2度之间的各实验组，药物作用后细胞稍变小，大多数细胞仍呈梭性，部分细胞变圆，随时间延长改变明显，24h可见大多数细胞变小变圆，细胞贴壁能力稍下降，极少细胞脱落，细胞生长仍呈集落性。空白对照组未出现上述现象，细胞呈典型梭形、平滑、折光性好，分裂期细胞变成圆形，折光变强(见图1～3)。 5 讨 论 热疗是一种古老的疗法，随着基础研究的深入及热疗设备的开发研制和应用，热疗已得到了迅速的发展。热疗除了能够直接杀伤癌细胞外，还具有放射增敏和化疗增敏作用。热疗造成的组织损伤主要取决于作用温度和持续时间，41℃以上即可以产生癌细胞杀伤作用，酸性环境对上述机制有促进作用。热疗剂量是影响疗效的最重要因素之一。体内及体外实验均证实热疗可以促进一些化疗药物的细胞毒作用。对大多数化疗药物而言，中等程度的热疗(40.5℃～43℃)可以最大限度地促进其疗效。但目前尚缺乏标准化的热化疗模式。 本实验采用对顺铂耐药的CAOV3/cDDP人卵巢癌细胞进行实验研究。实验结果显示，42℃热疗单独作用对肿瘤细胞的生长仅有轻度抑制作用，但它能显著增强顺铂对肿瘤细胞的抑制效应。受热42℃的顺铂与37℃生理温度下的顺铂相比较，前者对体外培养的肿瘤细胞有明显的杀伤作用(