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细菌胞外多糖提取分离技术探究进展摘要：细菌胞外多糖是当今进入工业化发酵生产的一类重要的多糖。由于多糖种类的不同，其分离纯化工艺不尽相同。本文综述细菌胞外多糖发酵生产中提取分离技术的研究进展，并比较了各种分离技术，介绍了针对极具商业价值的微生物多糖的几种新型提取分离技术，展望了微生物多糖研究的发展趋势。 关键词：胞外多糖；提取；分离；发酵 中图分类号：Q539 文献标识码：A 文章编号：1672－979X(2010)05－0218－03 多糖在自然界高等植物、藻类、微生物及动物体内均存在，分布极广。近年，微生物来源的多糖越来越引起人们的注意，尤其是易分离纯化且含量高的细菌和真菌的胞外多糖，已经广泛实现了工业化深层发酵。 1　细菌胞外多糖 细菌多糖主要以3种形式存在：黏附在细胞表面的荚膜多糖：构成细胞内成分的胞内多糖；合成后可分泌到介质中的胞外多糖。在实际的细菌培养中，荚膜多糖和胞外多糖经常粘连在一起，很难区分，所以有人将两者统称为胞外多糖。 2　发酵法生产胞外多糖 胞外多糖易与菌体分离，可通过深层发酵实现工业化生产，较之传统提取法，原料基本不受限制，产品收率和纯度较高，适于大批量生产。发酵法制各多糖主要通过菌种选育、培养基选择和发酵条件优化等提高收率。 发酵生产的多糖中很重要的一类为糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)。GAG通常具有较高的黏度，分离纯化时应了解发酵液的浓度、温度、pH、无机盐、剪切速度等因素对其黏度的影响，在保证多糖生物活性的前提下尽可能降低黏度以便提取分离。因此，提取分离前一般要对发酵液稀释处理。 3　胞外多糖的一般提取分离方法 胞外多糖提取分离主要包括灭菌、粗提取、除蛋白质及小分子等杂质、分级分离等几个步骤。 从发酵液中提取胞外多糖先要灭菌。目前灭菌的方法包括酶法、化学法、巴氏灭菌法等。酶法成本较高，化学试剂法容易改变pH值，影响产品中的有效成分，因此一般采取巴氏灭菌法。巴氏灭菌法由于温度较高还可提高多糖的溶解度，降低溶液的黏度，利于随后的离心或过滤。但温度过高则易致产物降解。 粗提取胞外多糖一般先将原料脱脂、脱色，提取物浓缩后加乙醇、丙酮等沉淀剂沉淀，沉淀部分可反复多次溶解和再沉淀。 常用的除蛋白质方法有Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、硫酸铵法及木瓜蛋白酶法等。Scrag法是经典的除蛋白质方法，加入多糖水溶液体积约1／5的氯仿和氯仿体积1／5的正丁醇，剧烈振摇使蛋白质变性，然后离心去除沉淀。Sevag法去除蛋白质效果较好，但操作复杂、费时，常需要反复几次，样品损失较大。Sevag法与上述其它方法结合使用效果较好。 胞外多糖去除蛋白杂质后，一般需进一步脱色。常用的脱色方法有离子交换法、氧化法、还原法、金属离子络合法和吸附法(纤维素、硅藻土、高岭土、活性炭等作为吸附剂)。DEAE－纤维素柱层析是较常用的脱色方法之一，不仅达到脱色目的，还可以分离多糖。过氧化氢是一种氧化脱色剂，使用时浓度不可过高，宜在低温下脱色，否则会引起多糖降解。含有游离蛋白质和色素的多糖，可通过生成金属络合物的方法加以去除，方法是加入斐林(Fehling)试剂生成不溶性络合物，经阴离子交换树脂吸附络合物脱色。 进一步纯化可采用超滤法，这是一种用于分子分离的膜分离法，操作条件温和，不需添加化学试剂，不损坏热敏产物。根据待分离物质特性选择不同规格的超滤膜，膜的孔径以相对分子质量(Mr)为单位。常用的有醋酸纤维素膜、聚砜膜、聚酰(亚)胺膜等。 分级分离是将不同的多糖分开，获得目标产物。氢氧化钡、氢氧化钙等可用于酸性多糖的分级分离。柱层析法也较常用，可分为两类：一类即上述的离子交换层析，另一类为有分子筛作用的凝胶柱层析。区带电泳主要按多糖的电荷性质不同实现分级分离，常用的有聚丙烯酰胺凝胶电泳和醋酸纤维素薄膜电泳，但只适用于少量多糖的分离。 4　几种新型提取分离技术 当前极具商业价值并已投入规模生产的细菌胞外多糖有：黄原胶(xanthan gum)、结冷胶(geHan gum)、普鲁兰多糖(pullulan)、透明质酸(hyaluronie acid，HA)等。随着多糖提取分离技术的不断提高和深入发展，近年出现了一些新技术，现以透明质酸为例，介绍几种能实现良好分离的新技术和新方法。 HA是由β－D－葡糖醛酸和β－D－N－乙酰氨基葡糖的双糖单位反复交替连接而成的酸性黏多糖，Mr分布范围104～107，现在主要通过微生物发酵获得。不同M的HA有不同的用途，因此，针对目标产物所需Mr的不同，生产时可加入透明质酸酶酶解大分子，再用分子排阻层析或阴离子交换层析分离目标分子。 Liu等在链球菌属分批培养过