腺病毒介导的人骨形成蛋白-7基因转染对人牙髓细胞增殖及分化的的分析研究.pdfVIP

腺病毒介导的人骨形成蛋白．7基因转染对人牙髓细胞增殖与分化的研究 腺病毒介导的人骨形成蛋白．7基因转染对人 牙髓细胞增殖与分化的研究 专 业：1：3腔临床医学 硕士研究生：秦伟 导 师：林正梅副教授 摘 要 目的：构建人骨形成蛋白一7(humarlmorphogeneticprotein，hBMP．7)腺病毒载 体并制备重组病毒液，检测经腺病毒介导hBMP．7基因转染的人牙髓细胞(dental pulp 殖及向成牙本质细胞分化的调节作用。为进一步开展牙髓暴露基因治疗的体外及 临床研究提供实验依据。 hBMP．7基因的重组穿梭质粒载体，酶切鉴定及测序以证实构建是否成功。采用 位置特异性重组方法构建hBMP．7基因重组腺病毒载体。用脂质体介导 293细胞扩增，纯化制取高滴度重组腺病毒。以相同的方法扩增和纯化Ad．EGFP。 性目的基因的腺病毒感染人牙髓细胞，Western blot鉴定重组腺病毒目的基因的 Kossa染色及半定量RT-PCR 表达情况。四唑盐比色法(MTT)、酶动力学法、Von 分别检测转基因细胞的增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性、钙化结节和牙本质涎磷蛋 白mRNA(DSPPmRNA)的表达情况。 结果：用位置特异性重组方法成功构建了携带hBMP一7基因的重组腺病毒 载体(Ad．hBMP一7)，其滴度约为1 胞的最佳感染复数为75；Westernblot检测出人骨形成蛋白．7的表达；经 Ad—hBMP．7转染的人牙髓细胞增殖能力无明显改变，同时其合成ALP的能力能 腺痫毒介导的人骨形成蛋白．7基因转染对人牙髓细胞增殖与分化的研究 够得到显著提高，矿化结节形成，DSPPmRNA的表达呈剂量和时间依赖性。 结论：Ad。hBMP．7转染人牙髓细胞后可高效稳定表达。Ad—hBMP一7显著促 进体外培养的人牙髓细胞向成牙本质细胞分化，而对细胞的增殖无明显改变。 关键词：骨形形成蛋白；腺病毒载体；牙髓细胞；基因治疗；组织工程 腺病毒介导的人骨形成蛋白一7基因转染对人牙髓细胞增殖与分化的石Jf究 ofadenovirus--mediatedhumanbone Study morphogeneticprotein-·7 on anddifferentiationofhumandentalcells proliferation pulp Major： Stomatology Name： Wei Qm Prof．LIN Supervisor：AssociateZheng-mei ABSTRACT cells detectthe ofhBMP-7inhumandental transferred Objective：Toexpression pulp adenoviralvectormediatedhBMP-7 effectsof by gene．The humanbone on anddifferentiationofhuman morphogeneticprotein一7prolif