广西地方标准《牛支原体的检测 多重聚合酶链反应法》（征求意见稿） 编制说明.docVIP

广西地方标准《牛支原体的检测 多重聚合酶链反应法》（征求意见稿）编制说明 一、项目的来源和目的 牛支原体肺炎是一种全世界广泛存在的重要牛传染病,可引起肉牛肺炎、奶牛乳腺炎、犊牛关节炎和肺炎、角膜结膜炎、耳炎。在美国，该病每年所造成损失达 1.40 亿美元；在欧洲,该病的发病率约 25%～33%，每年损失大约 1.44 亿～1.92亿欧元。2008年，我国部分地区从国内其他地区引进的肉牛暴发了以坏死性肺炎为主要特征的疫情,最后证实为牛支原体肺炎。随着我区近年来养牛业的快速发展，牛支原体肺炎成为了限制我区养牛业发展的严重病害之一，据本课题组调查，我区从山东、吉林等养牛大省引进的犊牛中基本都携带牛支原体。 牛支原体肺炎临床以呼吸系统症状为主, 主要表现为发热、咳嗽、流鼻涕;剖检病变以坏死性肺炎为主(俗称“烂肺病”), 可见明显坏死性、干酪样病灶。而引起无乳症的无乳支原体与牛支原体曾同属一个种, 也能感染牛群, 二者16S RNA 基因同源性很高。所以实际工作中很难区分这两种支原体。 牛支原体肺炎检测技术主要是传统的病原分离和生化特性鉴定。病原分离培养的条件苛刻，费时、费力、分离的成功率低。生化特性鉴定又不容易将牛支原体与无乳支原体进行区分。运用基于分子生物学技术的多重聚合酶链反应方法同时鉴定这两种支原体，是一种最为简便、快捷的方法，本规程旨在推广一种能快速检测牛支原体的多重聚合酶链反应方法，检测结果在半天内获得，其在我区的推广应用，为流行病学调查和临床诊断提供技术支持。将为保障我区绿色养牛产业发展做出贡献。 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是近年发展起来的一种分子生物学诊断技术，能在数小时内快速检测出痕量的病原核酸。它具有传统病原分离鉴定和血清学方法所无法比拟的特异、敏感和快速等优势。在发达国家，PCR已作为有效的病原检测手段得到了广泛应用。世界动物卫生组织（OIE）也将PCR方法列为多种动物病原最为可靠的检测方法之一。多重PCR技术一次反应可以检测多个基因，比单一PCR技术更为方便、快捷、经济，减轻了工作量。因此建立特异性强、敏感性高、快速、简捷的多重PCR检测方法是当前牛支原体病防治和流行病学调查工作迫切需要解决的问题之一。 为此，广西壮族自治区质量技术监督局下达文件《关于下达201年第二批广西地方标准制定（制订）项目计划通知》（桂质监函[201]183号）附件的编写任务通知，将《牛支原体的检测 多重聚合酶链反应法》广西地方标准的编制任务落实到广西壮族自治区兽医研究所，接到任务后，广西壮族自治区兽医研究所结合近几年的科研情况和人员情况，成立了以李军为组长，彭昊、陈泽祥、潘艳、许力干陶立、马春霞、、、等同志为成员的标准编制课题组，负责标准的起草工作。本操作程序是在充分参考文献资料及实验和生产应用验证的基础上，制订出适合于临床快速诊断牛支原体和无乳支原体的检测标准。 二、工作概况 （一）在检测方法研制方面的工作情况 广西壮族自治区兽医研究所”等项目以来，相关研究取得了以下研究成果：。 基于opp D/F建立的PCR检测方法，敏感性，只需即可，, 也能感染牛群, 二者16S RNA 基因同源性很高的无乳支原体进行区分，在检测上更好的应用性。 的快速检测：基于P 80/F建立的PCR检测方法，敏感性，只需即可，在临床上取得了良好的效果。 牛多重PCR的建立：根据牛opp D/F基因和P 80/F基因，设计合成两对特异性引物，牛和扩增长度分别为bp和bp，通过反应条件的优化特异性及扩增片段序列测定的验证，该方法可以快速便捷检测牛，并区分，可用于的流行病学调查及临床诊断。 为了确保制定的标准具有科学性、先进性、实用性和可操作性，标准编制课题组根据工作方案和任务要求进行了分工，分成个小组，其中一个小组负责做生产实践的调查研究，深入到广西南宁、贵港一些牛场及散养户进行实地调查研究了解养殖及疫病防控有关情况，并查阅相关的技术档案和规章制定，收集资料；另一个小组负责查阅国内外牛检测方面的标准、技术资料和研究报告。最后课题组将两个小组收集的材料进行汇总和整理，开始起草标准征求意见稿，于201年月完成了标准征求意见稿的起草工作，。 采用建立的牛多重PCR方法和传统观察法、方法，对采集自广西南宁、柳州、贵港等地的规模化牛场和散养户1份进行牛检测，阳性为份，阳性14份。反复比较验证种检测方法，观察法需要耗时较长，对检测人员技术要求高、建立的牛多重PCR方法具有稳定、快速、便捷的优点，可以在临床上进行推广应用。 国家标准GB/T.8-2001《》采用，对的进行观察检验，对实验设备、试剂和操作人员要求较高；而本标准针对我国牛和病原体。本标准制定的条款没有与现行的法律、法规及有关的国家标准中任何条款相矛盾。