人BTLA的原核表达、多克隆抗体制备及其在肺癌及结直肠癌组织中表达的研究.pdfVIP

人BTLA的原核表达、多克隆抗体制备及其 在肺癌和结直肠癌组织中表达的研究 摘 要 andT B、T淋巴细胞弱化因子(B lymphocyte 年发现的CD28家族共抑制受体，主要表达于T、B细胞，在DC、单核细胞及 NK细胞上也有表达，能负性调节T、B细胞的激活与增殖，维持树突状细胞在 内环境中的稳定，抑制记忆性CD8+T细胞的分化，其在肿瘤患者体内T细胞上 高表达，提示在肿瘤的发生发展中发挥作用。为了进一步研究BTLA在肿瘤发生、 发展中的作用，我们拟构建人BTLA(1出TLA)原核表达载体和表达蛋白并制各 多克隆抗体，通过免疫组化法检测肺癌和结直肠癌组织中BTLA蛋白的表达，并 分析其在肿瘤的发生、发展和侵袭转移中的作用。 【目的】 构建BTLA原核表达载体，诱导表达hBTLA融合蛋白，并经亲和层析法纯 化，将其作为抗原免疫家兔，制备兔抗hBTLA多克隆抗体，纯化抗体后，在蛋 白水平检测该分子在肺癌和结直肠癌中的表达情况，并分析BTLA基因在肿瘤的 发生、发展中的作用。 【方法】 1．构建含hBTLA胞外区目的基因的T载体克隆及原核细胞表达载体亚克 电泳鉴定，将重组基因工程菌扩大诱导表达，亲和层析法纯化诱导的蛋白。 2．将纯化的蛋白与弗氏完全佐剂乳化，将其作为抗原免疫家兔，获得兔抗 人免疫血清，经硫酸铵盐析纯化，获得初步纯化的兔抗hBTLA多克隆抗体，通 过双扩散试验和间接ELISA法检测多克隆抗体效价和纯度，westemblot及免疫 组化方法初步鉴定其活性。 3．收集手术切除的肺癌和结直肠癌组织标本，应用免疫组织化学方法检测 BTLA蛋白在肿瘤细胞中的表达情况，并分析其在肿瘤发生、发展中的作用。 4．用商品多抗和自制多抗建立ELISA夹心法，并对方法进行条件优化，测 定其准确度、精密度、重复性和线性范围，方法建立后可用于检测血清中可溶性 BTLA的含量。 ’【结果】 1．获得hBTLA胞外区重组基因工程菌的克隆，并表达具有抗原性的BTLA 融合蛋白。 2．获得纯化的llBTLA融合蛋白，并用其免疫家兔，得到兔抗hBTLA多克 隆抗体。以重组蛋白为抗原，用间接ELISA检测抗hBTLA抗血清的效价达到 l：20000。双向琼脂免疫扩散试验显示抗llBTLA多克隆抗体与抗原之I’日J形成单一 沉淀线，效价达到l：16，表明所制备的多抗效价较高，并具有良好的纯度。 3．免疫印迹分析抗hBTLA抗血清在分子量约15．72KDa处与相应的原核表 达蛋白呈现特异性结合条带，表明所制备的多克隆抗体具有较好的免疫学活性。 免疫组织化学染色证明抗体能与肿瘤组织中天然表达的hBTLA蛋白特异性结 合，与商品单抗检测结果一致。 4．22例肺癌标本和19例结直肠癌标本的免疫组化检测中，BTLA表达的阳 性率分别为32％和100％，表达部位位于胞浆和胞膜区，在肺癌和结直肠癌组织 中均有表达，但结直肠癌组织中的表达明显强于肺癌组织中的表达。 【结论】 ．． ．．“’ ． 成功构建了高效表达重组hBTLA蛋白的原核表达载体，获得高效稳定的重 组基因工程大肠杆菌表达菌株，经诱导表达的hBTLA融合蛋白具有免疫原性， 将其作为免疫原制备的兔抗hBTLA多克隆抗体能与纯化的外源性hBTLA融合 蛋白和天然表达的内源性BTLA蛋白发生结合反应，检测抗hBTLA多克隆抗体 效价、纯度、活性均达到预期要求。检测BTLA在蛋白质水平表达发现，BTLA 在肺癌和结直肠癌组织中均有表达，但结直肠癌组织中的表达明显强于肺癌组织 中的表达。BTLA可能参与肿瘤的发生、发展过程。 【关键词】BTLA；原核表达；多克隆抗体；肺癌；结直肠癌；免疫组织化学； Westemblot R730．1 【中图分类号】R392．1 【文献标识码】A 2 Prol‘aryotic