人SCL基因组腺病毒表达载体的构建.pdfVIP

摘 要 目的： 构建含人SCL基因的pDC315-SCL重组腺病毒载体,为下一步研究SCL基因在ICC样 细胞的功能奠定基础。 方法： 从含有人SCL基因的质粒中，采用PCR方法扩增SCL基因，将目的载体pDC315-EGFP 进行酶切后交换，其产物转化细菌感受态细胞，对克隆产物进行菌落PCR鉴定，对阳性 克隆产物进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的重组穿梭质粒。 pDC315-EGFP/SCL,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒 共转染 293细胞，包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC315-SCL经HEK293细胞扩增，纯化后测定 病毒滴度。通过观察绿色荧光蛋白的表达评估重组腺病毒对Cajal样间质细胞的转染率。 结果： PCR扩增的SCL基因片段长度为1036bp，测序结果以及重组质粒pDC315-EGFP-SCL 阳性克隆凝胶电泳鉴定均证明SCL基因成功克隆到腺病毒穿梭质粒真核表达载体中。 pDC315-SCL重组腺病毒载体通过PCR结果证明和Western Blot检测证实pDC315-SCL重组 10 腺病毒载体构建成功，滴度达到1×10PFU/mL，对膀胱Cajal样间质细胞的转染率可达 95%。 结论：成功构建了含人SCL基因真核表达载体pDC315-EGFP-SCL和应用AdMax载体系统成 功构建含人SCL基因重组腺病毒载体pDC315-SCL。pDC315-SCL重组腺病毒载体对Cajal样 间质细胞有很高的转染效率。 关键词：人SCL基因；pDC315-EGFP真核表达载体；PCR；重组腺病毒载体；转染 论文类型：A（应用研究） I Abstract Purpose: Recombinant adenovirus vector of human SCL gene pDC315-SCL was constructed in order to research SCL gene function in ICC-like cells in high sugar environment. Methods: From containing purpose of the SCL gene of plasmid, Using PCR method for the purpose of the SCL gene, the aim vector pDC315-EGFP to cut with enzymes carry through switching, the product translate into the cell about feeling of states bacteria. To growing of the bacterial colony carry out to identify through the PCR, the PCR positive identify of the clones need to analysis and sequencing, a sequence of analysis is correct, cloning is a success for containing purpose of the plasmid of the SCL gene. HEK293 cells were co-transected with the constructed recombinant shuttle plasmid pDC315-EGFP/SCL and large adenovirus helper plasmid pBHGlox(delta)E1,3Cre in mediation of liposome. The obtained replication-defective recombinant adenovirus pDC315-SCL was propagated in HEK293 cells, purified pDC315-SCL plasmid and determin