目标区域捕获文库制备.docVIP

HaloPlex目标区域捕获文库制备操作流程 1目的 2职责 3适用范围 本是Agilent HaloPlex目标区域捕获技术而制定的文库制备流程，所制备的文库适用于Illumina GA\HiSeq 2000 测序 4术语和定义 5操作步骤 5. 为方便实验操作，本SOP推荐进行12个样本的酶切反应，其中包括11个基因组DNA和1个Enrichment Control DNA (ECD)样本。在这一步，每个DNA样本会被平均分为8份，然后每份样本被2种不同的限制性内切酶酶切消化，最后每个DNA样本会得到8份酶切消化后的混合产物。 5.1.1 每个基因组DNA样品，取225ng的总量至0.2ml的PCR管，分别用ddH2O 稀释到45ul，终浓度为5ng/ul；另吸取45ul的ECD样本至额外的1个0.2ml的PCR管。 5.1.2 配制RE Master Mix： a.在1个1.5ml的EP管中加入476ul的RE Buffer和11.9ul的BSA Solution，震荡混匀并短暂离心。 b.准备一个新的8连管，分别加入56ul的RE Buffer/BSA mixture。 c.按照A-H的顺序，往8连管里面加入7ul的RE Enzymes（Green）。 d.同样按照A-H的顺序，往8连管里面加入7ul的RE Enzymes（Red）。 e.轻柔震荡混匀，然后稍微离心。 【注意】务必确保RE Enzymes（Green）和RE Enzymes（Red）的加样方向是一致的，否则有可能导致酶切效果不佳。 5.1.3 准备一个新的96孔板，使用8道排枪向每个孔里加入5ul的RE Master Mix。然后按照以下示意图，每列中分别小心加入5ul的DNA样本。其中1-11列为不同基因组DNA样本S1-S11，12列为ECD样本。 5.1.4 封膜，小心震荡混匀，然后稍微离心。 5.1.5 在热循环仪上（加热盖）37°C反应30min。 5.1.6 反应后通过对ECD样本的电泳分析验证酶切效果。酶切后的ECD样品中分别每个取4ul到新的0.2ml的PCR管中，80°C灭活5min。然后用Agilent 2100对这8个ECD酶切产物以及没有反应的ECD样本进行检测。反应完全的ECD酶切产物应该在125、225、450bp左右有3个明显的亮带。 备注：其中lane2-9分别为ECD酶切产物，lane10为未反应ECD样本。 【注意】不要在这一步就将1个DNA样本的8个酶切产物混合了。如果在限制性内切酶仍有活性的情况下将酶切产物混合，可能会导致不适当的酶切消化结果。DNA样本应该在杂交反应时混合，因为在该反应条件下，限制性内切酶是失活的。 5.2 HaloPlex探针杂交 5.2.1 杂交反应体系： Reagent Volume for 1 Reaction Volume for 12 Reactions DNA mixture 80ul Hybridization Solution 50ul 650ul HaloPlex Probe 20ul 260ul Index Primer N 10ul Total volume 160ul 910ul 5.2.2 按照上表的比例配好Hybridization Master Mix，震荡混匀，然后分别分装70ul至12个0.2ml的PCR管。 5.2.3 每个EP管里加入10ul不同的Indexing Primer Cassette（见附录2）。 5.2.4 随后在每个EP管逐一加入相对应的DNA样本的8个酶切产物，震荡混匀并稍微离心。 【注意】限制性内切酶在该反应体系中是没有活性的。对应的ECD样本，需额外加入32ul的ddH2O。 5.2.5 在热循环仪上（加热盖）运行程序：先95°C变性10 min；然后54°C杂交3 h。 5.3 目标DNA捕获 事先取出Capture Solution, Wash Solution和HaloPlex Magnetic磁珠，平衡至室温。 5.3.1准备HaloPlex Magnetic磁珠： a.为每一个杂交反应取40ul HaloPlex Magnetic磁珠于一新的1.5mL离心管，对于12个样本，则需500ul（含损失）。 b.将离心管放于磁力架上，待液体变澄清后，去除上清液,并小心吸干残留； c.加入等体积（500ul）的Capture Solution，重悬磁珠。 5.3.2从热循环仪中取出杂交反应管，立即往每个反应管中加入40ul已重悬的磁珠，上下吹打混匀，室温下静置15min。 5.3.3 简单离心，然后将离心管放于磁力架上，待液体变澄清后，去除上清液。 5.3.4 取下EP管，每个加入100ul Wash Solu