外源性Smad-7联合TIMP-1siRNA对大鼠肝纤维化干预治疗的实验探究.pdf

摘 要 目的： 本研究复制肝纤维化大鼠模型，通过腹腔注射经脂质体包埋的重组 Smad-7 与 TIMP-1siRNA 真核细胞表达质粒，对肝纤维化大鼠进行干预治疗，分析两种质粒及联合 作用对大鼠肝纤维化的影响。 材料和方法： 1. 四氯化碳复合因素法建立肝纤维化大鼠模型：40% 四氯化碳棉籽油溶液给大鼠皮 下注射, 0.3 mL/100 g 体重 (首次剂量 0.5 mL/100 g)，后每隔 4 天注射一次, 每次 3ml/kg, 共注射 12 次, 20%乙醇溶液作为唯一饮用液体, 并给予高脂高胆固醇饲料。设立正常对 照组大鼠, 同期皮下注射生理盐水, 剂量同实验组, 采用标准饲养方法。 2.重组质粒的导入：各干预组及对照组采用脂质体包埋法分别将 Smad-7/pcDNA3.1 （+ ）、TIMP-1SiRNA/pcDNA3.1(+)重组质粒及 pcDNA3.1(+)质粒各 100μg 导入大鼠肝纤 维化模型。S 组采用 Smad-7/pcDNA3.1 （+ ）质粒；T 组采用 TIMP-1SiRNA/pcDNA3.1(+) 质粒；S+T 组采用 Smad-7/pcDNA3.1 （+ ）+TIMP-1SiRNA/pcDNA3.1(+)质粒；空质粒对 照组给予 pcDNA3.1(+)质粒。同时正常对照组腹腔注射 0.9% 的生理盐水0.5mL 。每7 天 1 次至第 8 周。注射前各组重组质粒均按比例与脂质体 Lipofectmine2000 混匀，经腹腔 注射法导入大鼠体内。 3. 结果观察：应用苏木素-伊红染色及苦味酸-酸性品红染色观察肝组织病理形态学 变化，进行肝纤维化分级；应用免疫组化法观察肝组织中 III 型胶原蛋白的表达；采用 Western blot 法检测 I 型胶原蛋白表达，采用逆转录 PCR 技术（RT-PCR ）检测 Smad-2、 TIMP-1mRNA 的表达，同时检测 β-actin 的表达作为内参照，用计算机图像分析技术检 测以上指标表达的强弱。实验结果计量资料采用 SPSS 13.0 软件描述实验数据特征，作 Kruskal-Wallis 法非参数检验(成组设计多样本比较秩和检验及多样本间两两比较秩和检 验) ，P0.05 显示差异有显著性。等级资料病理形态学分级结果作 Ridit 分析。 结果： 1. 免疫组化法观察肝组织中 III 型胶原蛋白的表达：各治疗组 III 型胶原表达量均较 肝纤维化对照组减少，P0.05 ，差异有统计学意义；并且联合治疗组与各单一治疗组比 较：胶原表达明显减少，P0.01 ，差异有统计学意义。 2. Western blot 法检测 I 型胶原蛋白表达：各治疗组 I 型胶原表达量均较肝纤维化对 照组减少，P0.05 ，差异有统计学意义；并且联合治疗组与各单一治疗组比较：胶原表 达明显减少，P0.01 ，差异有统计学意义。 3. RT-PCR 检测 Smad-2、TIMP-1mRNA 的表达： 各治疗组 Smad-2mRNA 表达量均较肝纤维化对照组减少，P0.05 ，差异有统计学 意义；并且联合治疗组与各单一治疗组比较：Smad-2mRNA 表达量减少，P0.05 ，差异 I 有统计学意义。 各治疗组 TIMP-1mRNA 表达量均较肝纤维化对照组减少，P0.05 ，差异有统计学 意义；并且联合治疗组与各单一治疗组比较：TIMP-1mRNA 表达量减少，P0.05 ，差异 有统计学意义。 结论： 1.TIMP-1siRNA/pcDNA3.1(+)真核细胞表达质粒及 Smad-7/pcDNA3.1(+)真核细胞表 达质粒均能降低 I 、III 型胶原蛋白表达水平，尤以 TIMP-1 siRNA + Smad-7 联合治疗组 最为明显； 2.通过同时阻断 MMPs-TIMPs 系统和 TGF-β/Smad-7 信号通路进行抗纤维化，比单 独阻断其中一条通路抗肝纤维化效果好，进一步证实肝纤维化发生与发展是多种通路共 同参与的过程。 关键词: 肝纤维化; Smad-7; TIMP-1; RNAi; 质粒 I