产漆酶真菌的筛选.docVIP

产漆酶白腐真菌的筛选 学号：S113114 姓名：姚林锋 摘要：白腐菌是自然界中最重要的木质素降解菌,通过分泌胞外氧化酶—木质素降解酶降解木质素。漆酶是白腐菌木素降解酶系的组成成分,可催化大量酚类化合物和芳香胺的氧化。基于这一特点,漆酶已尝试地用于造纸木质素的处理、含酚工业废水的处理、纺织染料废水的处理、杀虫剂和农药的降解等。本文主要进行菌种的采样增殖初筛复筛鉴定酶活测定等，来筛选出优良的产漆酶白腐菌。 关键词：白腐菌 漆酶 筛选 白腐真菌(white-rot fungi)是一类丝状真菌因附生在树木或木材上引起木质白色腐烂而得名。木质素降解酶系主要包括三部份: 木质素过氧化物酶(lignin peroxidase, Lip）、锰过氧化物酶(manganese-dependent peroxidase,MnP)以及漆酶( laccase)[ ]。这些酶类在自然界碳素循环中占有重要地位。由于漆酶可在碳或氮存在条件下由菌体分泌。同时更重要的是漆酶具有780mV氧化还原电位能把分子氧直接还原为水在没有 H2O2 和其他次级代谢产物存在下可直接氧化底物[]。因此,漆酶与其他木素降解酶相比,具有更大的实际应用价值。漆酶是一种含铜多酚氧化酶，抗坏血酸氧化酶和哺乳动物血浆铜蓝蛋白同源都属于蓝色多铜氧化酶家族分子量在64-390kD之间。由于漆酶具有氧化与木质素有关的酚类和非酚类化合物以及高度难降解环境污染物的能力, 因此在食品工业、制浆和造纸工业、纺织工业、土壤的生物修复等领域具有广泛的应用前景[ ]。关漆酶及漆酶生产菌的研究正在成为国际上酶工程和环境微生物学交叉领域的研究热点。 高压火菌锅、无菌操作台、需氧培养箱。 俞创木酚、鞣酸。 PDA综合培养基:马铃薯提取液1OOOmI葡萄糖20gKH2P043.Og，MgSO4，H2O1.5g，维生素B1微量琼脂15.0 选择性培养基:俞创木酚1.0g，酒石酸钱0.1 g，蛋白陈2.6gMgS04，7H2O0.5g， KH2PO41.O g，Na2HP040.2g，琼脂18g加蒸馏水至1OOOmL。 PDA-Bavendamm培养基:在PDA培养基中加入蹂酸至终浓度为0.01/100mL。 四川大学实验基地确定5个采样点，采集深层土壤样品，用无菌水稀释为l-1_10-1010个不同浓度的土壤悬浮液。 将土壤悬浮液，结合涂布法，在PDA综合培养基上通过多次的划线分离培养直至获得纯菌株，于PDA斜面培养基上保种。 由于木质素结构的复杂性，许多木质素降解的研究利用木质素类典型化合物，这类化合物具有木质素的某些特定结构，包括单聚物香草酸、愈创木酚、苯酚、磷甲基苯酚二聚物愈创木基甘油-B-松柏醇醚(GGE）、脱氢联松柏醇(DCA), 1,2-二愈创木基丙烷-1,3-二醇等[]。本试验选用相对便宜的愈创木酚为唯一碳源的选择性培养基，从土壤中分离筛选出木质素降解菌。Nishida等认为，能在以愈创木酚为指示剂的培养基上产生变色圈的微生物具有降解木素的能力。对于白腐菌来说，变色圈的形成有两种一种是变色圈在菌丝的外圈，此时菌丝圈直径度色圈直径小于1;另一种是变色圈在菌丝的外圈形成菌丝圈直径与变色圈直径比值大于1的菌株[2]。 Ande和Eriksson的实验表明，菌丝圈与变色圈直径的比值可作为判断该菌是否能选择性降解木素的依据，比值小于1则该菌能选择性降解木质素比值大于1的菌则首先降解纤维素[]。因此本试验首先利用选择性培养基分离筛选出那些变色圈在菌丝外围形成的菌株个体，经过纯化后，获得了10株菌株进行第二轮筛选。 主要步骤：用打孔器打取直径为0.3mm×0.3mm的菌块，接种到选择性培养基上，于需氧培养箱中300℃条件下培养lOd，观察菌落周围棕红色变色圈的形成，挑选变 色圈在菌丝外围形成的菌株，并测量记录菌丝直径(dl)、变色圈直径(d2)以及计算两者比值(dl/d2)。根据所产生变色圈的大小及变色程度, 选出 d1、d2比值较小且生活力较高的菌株并用保藏培养基留种。 鞣酸平板法(Bavendamm方法)反映，能利用木质素的真菌其所分泌的漆酶能使酚类等化合物聚合，会在菌落周围形成棕褐色氧化带，呈现阳性反应不利用木质素，而仅仅利用纤维素的菌株则呈现阴性反应。因此可根据显色圈的直径大小和产生时间来判断其产漆酶性能的高低[]。PDA-Bavendamm平板显色反应，只是初步的判断菌株的产酶情况，杜海萍[7]等报道，变色圈的大小与酶活性的高低之间有必然的联系，但并未证明它们存在线性的正相关，本试验利用显色试验筛选出产木质素降解酶能力相对较强的菌株，有利于进一步研究产酶的确切情况。 复筛的方法是通过