蛋白质印迹法 Weste的rn Blot技术.pptVIP

  1. 1、本文档共22页,可阅读全部内容。
  2. 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
  3. 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载
  4. 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
  5. 5、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
  6. 6、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们
  7. 7、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
  8. 8、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
蛋白质印迹法 Weste的rn Blot技术

Western blot 实验技术 ; Western blot的定义 Western blot的基本原理 Western blot的一般流程 Western blot的常见问题;定义;基本原理;一般流程;蛋白质样品的制备;(1)25mg/mL BSA的配制: 取0.8mL蛋白标准配制液加入到一管蛋白标 准(20mg BSA)中,充分溶解后配制25mg/mL的蛋白标准溶液。配制后可立即使用,也以-20℃长期保存。 (2)1mg/mL BSA的配制: 取BSA贮备液25mg/mL(0.1mL),用1×loading buffer(2.4mL)稀释至2.5mL,按0.5mL分装成5个包装,标记放入-20℃。 (3)60% TCA工作液的配制: 取2.2g TCA(三氯醋酸)溶于3.67mL双蒸水中,即为60% TCA工作液,使用前配制。 (4)配制BSA标准系列和样品 如表格:;; 蛋白样品 5μl,1×loading buffer 45μl,ddH2O 50μl,TCA 66.7μl,放置15-30min,用酶标仪,λ=595nm处测定蛋白含量。; SDS电泳 基本原理: 在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基磺酸钠), SDS能断裂分子内和分子间氢键,破坏蛋白质的二级和三级结构,同时,在强还原剂(beta-巯基乙醇)作用下,使半胱氨酸之间的二硫键断裂。 蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中,与SDS分子按比例结合(多肽和SDS的质量比为1:1.4),形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物,所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量,从而消除了不同分子之间原有的电荷差异 。; 蛋白质-SDS复合物的形状近似于长的椭圆棒,它们的短轴是恒定的,而长轴与蛋白质分子量的大小成比例。 因此,蛋白质-SDS复合物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中的迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响,而主要取决于椭圆棒的长轴长度,即蛋白质亚基分子量的大小。 当蛋白质分子量在15KD到200KD之间时,电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。 ;电泳步骤: 1.清洗玻璃板 2.灌胶与上样 (1)玻璃板对齐后放在夹中卡紧,然后垂直卡在架子上准备灌胶 (2)配置10%的分离胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶至玻璃板高度的2/3处即可,然后胶上加一层水,液封后的胶凝的更快(30min)。;(3)当水与胶之间有一条明显的折射线时,说明胶已凝了。等三分钟胶完全凝固后倒去上层水,并用吸水纸将水吸干。 (4)按方法配置5%的浓缩胶,加入TEMED后积极摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶,然后将梳子插入浓缩胶中,待浓缩胶凝过后,两手分别捏住梳子的两端竖直向上轻轻将其拔出(一般20分钟时最好拔)。 (5将装置放入电泳槽中,加入足量的电泳液后开始准备上样(电泳液至少漫过小玻璃板内侧);(6)根据测出的蛋白含量,计算出含一定质量蛋白的溶液体积即为上样量。上样前要将蛋白于沸水中煮沸10min使蛋白变性,并12000r/min离心5min。 3.电泳 在浓缩胶中电压可为80V,至溴酚蓝进入分离胶后将电压转换为90V,电泳至溴酚蓝离下边缘1cm处时停止电泳。;转 膜;2.将玻璃板撬开,去掉小玻璃板。将浓缩胶轻轻刮去,小心的剥下分离胶先放于转移缓冲液中。(在撬玻璃板时要小心,因玻板易碎。剥离分离胶时要注意不要弄破分离胶) 3.放置顺序:阴极-海绵垫-三层滤纸-分离胶-膜-三层滤纸-海绵垫-阳极。(顺序不能反了,膜盖上后不可移动,每盖一层,要用玻棒擀出其中的气泡。第二、三步时戴手套,因转移缓冲液中含甲醇,实验室要开门空气流通。) 4.把夹子放入转移槽中,黑面对对槽的黑面,白面对槽的红面,转移时会产热用冰块降温。一般150V,400mA转膜1:30h。 5.将膜晾干备用。;封闭;一抗杂交;二抗杂交;底物显色;Western blot的常见问题;5.凝胶肿胀或卷曲 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min. 6.在转膜过程中会产热,因为缓冲液中离子浓度太低,电流或电压太高。所以应放置冰块降温。 7.背景太深: 原因: 7.1 膜没有充分浸湿 7.2膜或缓冲液污染 7.3封闭液封闭不完全 7.4 抗体浓度过高

文档评论(0)

ayangjiayu1 + 关注
实名认证
文档贡献者

该用户很懒,什么也没介绍

1亿VIP精品文档

相关文档