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蛋白质印迹法 Weste的rn Blot技术
Western blot 实验技术 ;
Western blot的定义
Western blot的基本原理
Western blot的一般流程
Western blot的常见问题;定义;基本原理;一般流程;蛋白质样品的制备;(1)25mg/mL BSA的配制:
取0.8mL蛋白标准配制液加入到一管蛋白标 准(20mg BSA)中,充分溶解后配制25mg/mL的蛋白标准溶液。配制后可立即使用,也以-20℃长期保存。
(2)1mg/mL BSA的配制:
取BSA贮备液25mg/mL(0.1mL),用1×loading buffer(2.4mL)稀释至2.5mL,按0.5mL分装成5个包装,标记放入-20℃。
(3)60% TCA工作液的配制:
取2.2g TCA(三氯醋酸)溶于3.67mL双蒸水中,即为60% TCA工作液,使用前配制。
(4)配制BSA标准系列和样品 如表格:;;
蛋白样品 5μl,1×loading buffer 45μl,ddH2O 50μl,TCA 66.7μl,放置15-30min,用酶标仪,λ=595nm处测定蛋白含量。; SDS电泳
基本原理:
在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基磺酸钠), SDS能断裂分子内和分子间氢键,破坏蛋白质的二级和三级结构,同时,在强还原剂(beta-巯基乙醇)作用下,使半胱氨酸之间的二硫键断裂。
蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中,与SDS分子按比例结合(多肽和SDS的质量比为1:1.4),形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物,所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量,从而消除了不同分子之间原有的电荷差异 。; 蛋白质-SDS复合物的形状近似于长的椭圆棒,它们的短轴是恒定的,而长轴与蛋白质分子量的大小成比例。
因此,蛋白质-SDS复合物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中的迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响,而主要取决于椭圆棒的长轴长度,即蛋白质亚基分子量的大小。
当蛋白质分子量在15KD到200KD之间时,电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。
;电泳步骤:
1.清洗玻璃板
2.灌胶与上样
(1)玻璃板对齐后放在夹中卡紧,然后垂直卡在架子上准备灌胶
(2)配置10%的分离胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶至玻璃板高度的2/3处即可,然后胶上加一层水,液封后的胶凝的更快(30min)。;(3)当水与胶之间有一条明显的折射线时,说明胶已凝了。等三分钟胶完全凝固后倒去上层水,并用吸水纸将水吸干。
(4)按方法配置5%的浓缩胶,加入TEMED后积极摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶,然后将梳子插入浓缩胶中,待浓缩胶凝过后,两手分别捏住梳子的两端竖直向上轻轻将其拔出(一般20分钟时最好拔)。
(5将装置放入电泳槽中,加入足量的电泳液后开始准备上样(电泳液至少漫过小玻璃板内侧);(6)根据测出的蛋白含量,计算出含一定质量蛋白的溶液体积即为上样量。上样前要将蛋白于沸水中煮沸10min使蛋白变性,并12000r/min离心5min。
3.电泳
在浓缩胶中电压可为80V,至溴酚蓝进入分离胶后将电压转换为90V,电泳至溴酚蓝离下边缘1cm处时停止电泳。;转 膜;2.将玻璃板撬开,去掉小玻璃板。将浓缩胶轻轻刮去,小心的剥下分离胶先放于转移缓冲液中。(在撬玻璃板时要小心,因玻板易碎。剥离分离胶时要注意不要弄破分离胶)
3.放置顺序:阴极-海绵垫-三层滤纸-分离胶-膜-三层滤纸-海绵垫-阳极。(顺序不能反了,膜盖上后不可移动,每盖一层,要用玻棒擀出其中的气泡。第二、三步时戴手套,因转移缓冲液中含甲醇,实验室要开门空气流通。)
4.把夹子放入转移槽中,黑面对对槽的黑面,白面对槽的红面,转移时会产热用冰块降温。一般150V,400mA转膜1:30h。
5.将膜晾干备用。;封闭;一抗杂交;二抗杂交;底物显色;Western blot的常见问题;5.凝胶肿胀或卷曲
可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min.
6.在转膜过程中会产热,因为缓冲液中离子浓度太低,电流或电压太高。所以应放置冰块降温。
7.背景太深:
原因: 7.1 膜没有充分浸湿
7.2膜或缓冲液污染
7.3封闭液封闭不完全
7.4 抗体浓度过高
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