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质粒的提取的
分子细胞遗传学实验;平时成绩, 考勤和课堂表现, 50%
实验及实验报告, 50%
实验报告评分细则
实验原理 10分
实验目的 5分
仪器材料和试剂 10分
实验步骤 20分
实验结果与分析 45分 (其中,实验结果20分, 结果分析25分)
心得体会 10分; 实验一、质粒DNA的提取 ;一、实验目的;一、实验目的;二、实验原理;三、实验器材与试剂;四、实验步骤;柱平衡步骤:加入500μL 的平衡液BL,12,000 rpm (~13,400×g ) 离
心1 分钟。倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
2. 取1-5 mL(3mL)过夜培养的菌液,10,000 rpm 离心1 分钟,尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
3. 向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μL 溶液P1,使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
4. 向离心管中加入250 μL 溶液P2,温和地上下翻转6-8 次使菌体充分裂解。
5. 向离心管中加入350 μL溶液P3,立即温和地上下翻转6–8 次,充分混匀,此时将出现白色絮状沉淀。10,000 rpm离心10 分钟。
6. 将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3 中 (吸附柱放入收集管中),注意尽量不要吸出沉淀。10,000 rpm 离心30-60 秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3 放入收集管中。
;8. 向吸附柱CP3 中加入600 μL漂洗液PW ,10,000 rpm离心60 秒,倒掉收集管
中的废液,将吸附柱CP3放入收集管中。
9. 向吸附柱CP3 中加入500 μL 漂洗液PW,10,000 rpm 离心60秒,倒掉收集管中
的废液。
10. 将吸附柱CP3 放入收集管中, 12,000 rpm (~13,400×g) 离心2 分钟,将吸附柱
中残余的漂洗液去除干净。
11. 将吸附柱CP3 置于一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位滴加50μL
ddH2O (或洗脱缓冲液EB),室温放置 6 分钟,12,000 rpm (~13,400×g) 离心
1 分钟将质粒溶液收集到离心管中。
12、离心管中收集的就是洗脱下来的质粒DNA;Ⅲ、质粒的琼脂糖凝胶电泳; 5. 拔掉梳子,将胶放入电泳槽内(保证电泳缓冲
液足够淹没过胶面)
6. 将15uL 质粒洗脱液与3uL的DNA上样缓冲液
(使DNA沉降至点样孔内+电泳指示剂)混合,
加于1% Agarose 做凝胶电泳分析,检测其纯
度和目测定量。
如果质粒质量较好,则剩余质粒-20℃保存备用。可用于原位杂交探针标记。
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