肝星状细胞活化对IGFBP2、IGFBP6、IGFBP7（rP1）表达影响地.pdfVIP

山西医科大学璜士学位论文 增殖分化、黏附和集落形成等IGF．II所诱导的作用“”。我们前期的实验研究发现，在肝 纤维化和肝硬化患者肝组织中，IGFBP2、6的表达较正常人肝组织均显著增加，肝硬化 13 组又明显高于肝纤维化组，并且IGFBP2、IGFBP6与TGF1的高表达成正相关关系，由 B 纤维化形成发展中两个重要因素HSC、TGF i有怎样的关系以及IGFBP2、6在肝纤维 化发生机制中扮演怎样的角色均有待进一步的研究证实。本实验以体外培养的HSC—T6 13 作为研究对象，用不同浓度的TGF 成的作用。 材料与方法 1．材料 1．1细胞来源 FriedmanS．L．惠赠。 大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)由美国Prefessor 1．2细胞培养材料 养瓶(25cm2)购自比利时Orange Scientific公司，移液管(5ml和2m1)为E．u公司产品。 1．3主要试剂 ’ Blot检测 Cruz公司产品，WesternBlot 所用一抗IGFBP2、IGFBP6山羊抗人多克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品、免疫细胞化学染色所用抗山羊 检测所用二抗为驴抗山羊二抗为美国Santa 二抗为免疫组化试剂盒(SP法)提供，购自福建迈新生物技术开发有限公司，内参照13-actin (Proteia 色试剂盒购自福建迈新生物技术开发有限公司，胞浆．胞核蛋白抽提试剂盒购自北京普利 莱技术有限公司。 1．4仪器设备 无菌细胞培养室、超净工作台(南通医疗器械公司生产)、细胞培养c02孵箱(美国 山西医科大学焉士学位论文 电热恒温干燥箱、液氮生物容器、器皿洗刷装置、电泳仪(北京六一仪器厂产品)、凝胶 成像分析仪(GDS．8000，美国UVP公司产品)。 2．方法 2．1大鼠肝星状细胞株HSC-T6的培养 RPMll640，含10％胎牛血清，Hepes 素。用0．05％的胰蛋白酶消化吹打后传代，每周传代2—3次。 实验时使用的细胞为培养的传代细胞，待培养的HSC．T6达对数增长期时换培养液， 同时加入处理因素，作用时间为24小时(我们在预实验中确定的最适作用时间)。 2．2实验分组 ，(1)将接种于12孔细胞培养板中的细胞按每孔一个处理组分5组：正常对照组和 1，正常对照组加入等量PBS，24小时后收集细胞爬片并固定，免疫细 16ng／ml的TGFl3 胞化学染色观察各组IGFBP2、IGFBP6的表达。各组实验重复6次。 (2)将培养的细胞按每个培养瓶～个处理组随机分为5组：正常对照组和TGFB1处 的TGFl3 I，正常对照组加入等量PBS，24小时后收集细胞并抽提细胞胞浆蛋白进行 WesternBlot分析以观察各组IGFBP2、IGFBP6的蛋白表达。每组实验重复6次。 23免疫细胞化学染色 采用链霉素抗生物素．过氧化酶免疫组化试剂盒(SP法)进行免疫细胞化学染色，一 抗工作浓度l：200，阴性对照为磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗。结果判定：胞浆内出 说明书进行，操作步骤如下： 氧化物酶阻断剂室温处理lO分钟以灭活内源性过氧化物酶，PBS洗涤3分钟× 3次。 (3)正常非免疫动物血清封闭，室温10分钟(非免疫动物血清为二抗动物血清，以 减少非特异性结合)，甩去多余液体，不洗。 以PBS代替一