土壤中蛔虫卵的检测429.doc

土壤中蛔虫卵检测 一、背景 卫生部于2006 年在全国设立了22个土源性线虫病监测点开展监测工作 ,监测方案中要求对每个监测点进行人群土源性线虫病监测的同时, 还需监测土壤中人蛔虫卵的污染情况。2006～2010年的监测数据显示，土源性线虫病监测点土壤中人蛔虫卵检出率分别为37.1%，29.5%，25.9%，31.3%和24.4%，统计分析表明，土壤人蛔虫卵检出率与人群蛔虫感染率呈正相关，因此土壤中蛔虫卵的污染情况是评价环境卫生状况的一项重要指标。 二、原理 先用碱性溶液与土壤样品充分混合以分离蛔虫卵与土壤颗粒，再加入比重较大的液体使得比重较轻的蛔虫卵漂浮在溶液表面，收集后镜检计数。 三、采样要求 1分别从表面及2～3厘米深处采取土样，因为虫卵存活时间与土层深度有关； 2在用人粪施肥的农场和菜地可分别在陇上和犁沟中取土样，同时还应取20厘米深处的土样，以确定虫卵附着在根块植物上的可能； 3为了测定不同局部气候条件下虫卵存活率，要从有日光照射和荫蔽区采取土样； 4厕所、庭院、厨房取表层土； 5每份土样约100g。 四、步骤 1土样处理：剔除菜叶、树皮等大杂物，压碎土样中的大颗粒；然后用孔径3mm的铜筛和孔径为2mm的铜筛过筛，收集过筛后的土样。 2分离：取50ml大离心管，放入过筛后的土样10g，加5%氢氧化钠溶液至40或45ml刻度线。用橡皮塞紧塞管口，在振荡器上振荡15分钟，可反复3～4次，待充分混合后，以2000rpm,离心4min。 3漂浮：弃去上部的氢氧化钠，加入饱和硝酸钠溶液充分搅拌混匀，2000rpm离心4min，再加饱和硝酸钠溶液满至管口，覆上18mm×18mm盖玻片。 4 计数：静置15min后，将盖玻片迅速翻转取下，置于载玻片上镜检，同时再覆上第二张盖玻片，如此反复，共计数3～4张盖玻片。 五、影响土壤蛔虫检出率的因素 1 漂浮液的比重：漂浮液的比重是影响蛔虫卵检出率的重要因素，用比重大的溶液作为漂浮液效果较为理想，与饱和硫酸锌、硫酸镁、氯化钠等盐溶液相比，饱和硝酸钠的比重最高，用作漂浮液蛔虫卵的检出率最高。 2土壤性质：土壤性质决定了虫卵与土壤颗粒粘合的程度，蛔虫卵检出率沙土最高，壤土次之，粘土最低。 3离心的时间与次数：延长离心时间、提高离心速度或增加离心次数均可以提高蛔虫卵与土壤颗粒的分离效果进而提高检出率。 六、蛔虫卵形态 受精蛔虫卵呈短椭圆形或圆形，卵壳厚，双线层，外包一层乳头状突起的蛋白膜，呈棕黄色。未受精蛔虫卵与受精卵相比显得狭长，多为长椭圆形，卵内充满大小不等油滴状卵黄颗粒。 受精蛔虫卵 受精与未受精蛔虫卵 七、蛔虫卵活力测定 1直接镜检法 活的受精蛔虫卵：内含一个球形的卵细胞，卵壳两端和卵细胞之间，有半月形的空隙，卵内的卵黄颗粒清晰而致密；若卵内含幼虫，虫体的前后部没有颗粒，中部颗粒清晰而有金属光泽，有立体感，镜检时，注视或轻压，可见有轻微蠕动，强压后，有时可挤出幼虫。 死受精蛔虫卵(变性卵)：卵细胞移向一端，或向不定部位呈球状收缩，致使卵壳两端呈现有大小不等的半月形空隙；卵内脂肪变性，形成空泡；卵细胞颗粒减少或消失；细胞质浑浊，呈黑色或棕黑色；卵壳的一侧或两侧向内凹陷或破裂；只有蛋白质壳，而缺内容物。若卵内含幼虫，虫体内几乎充满颗粒，且模糊不清，无金属光泽，缺乏立体感，久久不见蠕动，稍稍加热或轻压，不会蠕动；强压时，虽能挤出幼虫，但也不改变其原来的卷曲状态。 2蛔虫卵培养法 (1)在直径10～12cm的玻璃平皿底部平铺一层厚约0.5cm的脱脂棉； (2)在脱脂棉上铺一张直径与平皿等大的普通滤纸； (3)在滤纸上，再放一张直径2cm的小滤纸，将虫卵滴在小滤纸片上； (4)加入2%福尔马林液，以湿透滤纸和脱脂棉； (5)放入在28～30℃温箱中培养1个月观察虫卵死活。 (6)培养一个月后自皿中取出小滤纸片，将虫卵置于载玻片上，滴加50％甘油溶液，使其透明后，根据形态，鉴定卵的死活。凡含有幼虫的，都认为是活卵，其他阶段的或单细胞的，都判为是死卵。 3美蓝、伊红、硼砂染色法 (1)美蓝、伊红、硼砂染液（简称M.E.B染液）的配制 将0.2g美蓝加入100ml蒸馏水中煮沸10分钟，加入硼砂0.5g，再煮沸10分钟，冷却后加入伊红0.1g，待完全溶解后过滤备用，pH值为10～11，在室温中可放置1.5年。 (2)脱蛋白膜:将收集的蛔虫卵加入30%次氯酸钠，作用1分钟，并经常振荡，再用蒸馏水洗2次，即可脱掉蛋白质膜。 (3)染色镜检:吸取虫卵沉淀物一滴置于载玻片上，加M.E.B染液一滴，覆盖玻片，静置3～5分钟后镜检。或者，吸取虫卵沉淀物1滴放入小试管内，加入染色液染30分钟，再用蒸馏水洗2～3次，吸取沉淀物镜检。 (4)鉴