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论桂枝茯苓丸对荷瘤鼠肿瘤细胞凋亡影响 　　　论文关键词：桂枝茯苓丸；凋亡；SurvivinmRNA 　　论文摘要：目的：探讨桂枝茯苓丸诱导肿瘤细胞凋亡机制，为桂枝茯苓丸(GFW)开发应用提供实验依据。方法：计算抑瘤率，流式细胞仪测定细胞凋亡率，电镜观察肿瘤细胞超微结构。原位杂交法检测SurvivinmRNA表达。结果：GFW抑瘤率为38.93％，流式细胞仪检测GFW组凋亡率17.79％，与模型组比较，差异有统计学意义。GFW组镜下可见瘤细胞以凋亡变化为主。内膜结构完好，核膜清晰，细胞核固缩，染色质团块状散布核内或边集核膜下，并可见凋亡小体。GFW下调肿瘤细胞SurvivinmRNA表达，与模型组比较，差异有统计学意义。结论：GFW诱导肿瘤细胞凋亡，其机制可能与下调SurvivinmRNA表达密切相关。 　　中医认为血瘀是肿瘤的主要成因之一，桂枝茯苓丸是一活血化瘀方剂，广泛用于各种血瘀症的治疗，临床实践证明具一定的抑瘤作用，但对其抑瘤机理的研究并不深入。本文选用荷瘤小鼠作为研究对象，观察桂枝茯苓丸(GFW)对肿瘤细胞的诱导凋亡作用，以其从分子水平上探讨GFW抗肿瘤效应机理，为GFW的临床应用提供理论依据。 　　 　　1　材料与方法 　　1．1　主要仪器和试剂　原位杂交试剂盒购白天津灏洋生物技术有限公司。OLYMPUS显微镜(日本)、HITACHI－H500型透射电镜(德国菲利蒲公司)、FACSCALIBUR流式细胞仪(美国BD公司)、SB651旋转蒸发仪(日本RIKAKI公司)、HIMAS－2000多媒体彩色病理图文分析系统(同济医大)。 　　1．2　实验动物　40只昆明小鼠，体重(20±2)g，雄性，由齐齐哈尔医学院实验动物中心提供。 　　1．3　瘤株S180瘤株，由黑龙江省肿瘤研究所提供 　　1．4　药物　桂枝茯苓丸：按《金匮要略》记载标准，生药均购自齐齐哈尔市中医院。桂枝、茯苓、桃仁、牡丹皮、赤芍各药等量，加适量水，浸泡2h，先文火后武火煎煮2次，经过滤除渣后，水浴浓缩，配成1g/mL的水煎剂，置4℃保存备用。 　　环磷酰胺(Cylophosphamide，CY)，山西普德药业有限公司出品，批号 　　1．5　动物模型　取腹腔接种10天的荷瘤小鼠，在无菌条件下抽取腹水(乳白色，黏稠)，放入无菌容器内，置冰块保存。用0.4％台盼蓝生理盐水液计数(计活细胞大于95％)，用生理盐水调细胞浓度至5×106/mL。取KM小鼠30只，每只鼠右侧腋下皮下注射0.2mL瘤细胞悬液。 　　1．6　动物分组及给药方法　将荷瘤鼠随机分为3组，每组10只，分别为模型组、实验组、CY组，另取10只未荷瘤小鼠作为正常对照。模型组(Modelgroup)：生理盐水灌胃0.2mL/(10g·d)；中药组(GFWgroup)：GFW灌胃0.2mL/(10g·d)；环磷酰胺组(CYgroup)：腹腔注射CY20mg/(kg·d)。接种后次日给药，各组每天给药1次，连续10天。 　　1．7　细胞凋亡的检测(流式细胞仪－单激光单染色法)小鼠脱颈处死，无菌取腋下实体瘤，常规制备瘤细胞悬液，调整浓度1×106/mL，1500r/min离心5min，弃上清，PBS洗1次，加70％冷乙醇1mL,4℃固定30min。离心5min，弃上清，PBS洗2次。加50mg/mLPI染液600mL染色，30min后上机测定。 　　1．8　透射电镜观察形态学改变　每组随机取2块瘤组织，将瘤组织快速投入2.5％戊二醛固定液固定2h以上，磷酸缓冲液漂洗，1％锇酸后固定1－2h，缓冲液漂洗20min，丙酮梯度脱水，浸透、包埋、制备超薄切片，醛酸双氧铀和柠檬酸铅染色，电镜观察并拍片。 　　1．9　原位杂交瘤组织及时固定，切片常规脱蜡至水。3％H2O2室温封闭10min，PBS洗，暴露mRNA核酸片段，滴加预杂交液20μL，40℃3h，不洗，Survivin探针杂交液20μL，滴加40℃杂交过夜，杂交后洗涤，滴加生物素化抗地高辛37℃60min，原位杂交用PBS洗5min×4次，滴加高敏过氧化物酶链亲和索复合物工作液，37℃60min，原位杂交用PBS洗5min×4次，DAB显色，苏木素复染，常规酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。本实验设2张阴性对照片，1张用PBS代替探针，1张用PBS代替生物素化抗地高辛。 　　1．10　统计方法　Survivin结果利用HIMAS－2000多媒体全自动图像分析仪检测，所得数据经SPSS11.0系统处理，采用OneWayANOVA法，两两比较用SNK法。结果用x±s表示。 　　 　　2结　果 　　2．1　抑瘤率　与模型组比较，GFW组、CY组瘤重低于模型组瘤重，差异有统计学意义(P＜0.05)。GFW组与