应用CSC-GE-80基因芯片筛查人子宫内膜早期异位种植血管生长相.docVIP

应用CSC-GE-80基因芯片筛查人子宫内膜早期异位种植血管生长相 　 作者：王宁宁， 张玉凤， 张红霞， 谭金凤， 谢洪哲， 姚书忠， 庄广伦， 牛刚， 黄建昭， 何勉 【摘要】 【目的】 探讨子宫内膜异位早期种植的相关基因，特别是与早期种植相关的血管生长基因。【方法】 采用裸鼠人子宫内膜皮下种植的方法，建立裸鼠人子宫内膜异位症模型，在种植后14 d，取出成模病灶与未种植内膜进行CSC-GE-80基因芯片筛查比较。【结果】 在基因表达谱中最有显著性上调基因50个，最有显著性下调基因47个，包括生长因子和细胞因子及其受体的变化，其中生长因子受体结合蛋白10（growth factor receptor-bound protein 10，Grb10）与丁酸盐反应因子1（butyrate response factor 1 ）中表皮生长因子（EGF-response factor 1）上调明显，下调明显胰岛素样生长因子结合蛋白7（insulin-like growth factor binding protein 7）。【结论】通过基因筛查我们初步考虑生长因子结合蛋白10（growth factor receptor-bound protein 10）有可能参与早期异位内膜的血管生长。 【关键词】 子宫内膜异位症； 早期种植； 裸鼠模型； 基因芯片； 血管生长 子宫内膜异位种植的原因，一直是人们是人们关注的热点。在我们前期的研究中，通过裸鼠进行人子宫内膜的异体异位种植，我们发现血管生成及其相关因子如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）在异位内膜的早期种植与生长的过程中，起十分重要的作用[1,2]。但子宫内膜异位种植的早期，究竟是哪些基因发生变化或者在这一过程中起到作用，仍不十分清楚。我们拟通过基因芯片筛查种植在裸鼠的人子宫内膜异位病灶，为早期的种植相关基因提供了一定的理论依据。 1 材料与方法 1．1 实验动物 由中山大学实验动物中心提供SPF级饲养BALB/c裸鼠, 雌性,体质量17~21 g,实验过程饲养在清洁环境，（温度：22～24 ℃，湿度：45%～70%，12 h黑白交替），每1只放1笼，共5只，饲养予以灭菌的水与饲料，每周添加鸡蛋、葵花籽以增加蛋白质等营养的摄入。 1.2 人子宫内膜组织的获取 子宫内膜取自子宫腺肌症伴盆腔子宫内膜异位症患者2例，年龄分别为43与47岁。手术前6个月未进行激素类药物治疗，在进行全子宫切除后立即进行内膜组织的刮取，种植前部分内膜进行HE染色组织病理分析。取材后将内膜无菌保存在德氏改良基础培养基（Dulbcco′s modifed eagle medium，DMEM）培养液中，一部分剪成3 mm×3 mm大小，另一部分继续剪成0.5 mm×0.5 mm碎屑液,诊刮后60 min内完成皮下种植术。两例患者术后病理均提示子宫腺肌症，分泌期子宫内膜。 1.3 BALB/c裸鼠人子宫内膜异位症的模型建立 详细方法参照参考文献[1]进行,子宫内膜裸鼠皮下异位种植14 d成模后取出进行检测。 1.4 主要试剂 Cy3荧光素标记的单克隆抗α-平滑肌肌动蛋白抗体（Cy3 conjugated monoclonal anti-α-smooth muscle actin clone, 1 ∶ 400）购自英国Sigma公司；FITC荧光素标记单克隆羊抗兔抗体（1 ∶ 200）购自购自美国Santa Cruz公司。DMEM培养液购自GiBco公司。Trizol Reagent 购自Life Technologies公司。Qiagene RT-PCR、Qiagene快速PCR纯化试剂盒购自Qiagene公司。Ambion messageAmp aRNA试剂盒购自Ambion公司。CyScribe cDNA荧光标记试剂盒购自Amersham生物制药技术有限公司。基因表达谱芯片CSC-GE-80由深圳微芯公司提供。 1.5 种植病灶的基因芯片检测 1.5.1 总RNA提取 保护液中保存的小块新鲜组织采用Trizol的方法进行提取与微量扩增、纯化，把所得到的cDNA真空抽干至体积小于8 μL，并保存在-20 ℃。接着RNA的扩增aRNA的纯化参照试剂盒进行,将aRNA样品于-80 ℃存放，取5～20 μg进行反转录标记。 1.5.2 探针标记与芯片杂交 探针标记采用aRNA 10 μg,second round primer1μL, Spike RNA 2 μL, DEPC water加至 10 μL,70 ℃ 5 min变性，然后冰上冷却后，采用Buffer 4 μL, 0.1 mol/L DTT 2 μL, dNTP mix 1