应用RFLP及SSCP分型技术进行大肠杆菌不同血清型鉴别.docVIP

应用RFLP及SSCP分型技术进行大肠杆菌不同血清型鉴别 　 作者：李波，洪帮兴，莫浩联，戴京晶 【关键词】 大肠杆菌 　　致病性大肠杆菌有不同的血清型，这些不同的血清型在致病性上差异较大，如产毒性大肠杆菌常引发毒素性食物中毒，而O157可以引起严重的出血性结肠炎［1］。在临床诊断治疗和流行病调查中，要对致病性大肠杆菌菌株进行快速分离鉴定。常规分离培养及血清学鉴定往往需要3～5天的时间，延误疾病的治疗和疫情的控制。从生物学特性上进行亚种的鉴定往往比较困难，也很难追踪菌株的流行态势。从基因水平进行属种乃至亚种的鉴定不但可以快速鉴定病原菌的种属，还可以进一步追踪病原菌的亚种、血清型及遗传上的亲缘关系。建立在PCR基础上的RFLP和SSCP技术，就是通过扩增病原菌的特异性基因片段，然后通过酶切分析法、单链构象多态性分析进行属［2］的鉴定、甚至属内种的鉴定［3］。即使是同种细菌的不同亚种、血清型，由于其时间、地点来源的不同，在基因水平上会出现一定的变异，这些变异为追踪菌株的来源和进化关系提供了方便。SSCP技术甚至可以检测出基因片段中单个碱基的改变。本文旨在探讨选取GroEL基因片段，运用PCR-RFLP和PCR-SSCP技术，进行大肠杆菌不同血清型别的鉴定，以期为临床快速鉴别诊断及流行病学调查提供方法依据。 　　1 材料和方法 　　1.1 菌株的来源 标准菌株选取6株5种不同血清型大肠杆菌。另选取葡萄球菌属种的金黄色葡萄球菌1株作为研究中的对照菌株。以上所有菌株均为本室保存的标准菌株。将菌株复苏后接种于相应的增菌培养基培养24h后转种至相应的选择培养基养24～36h。 　　1.2 菌株DNA的提取 纯种菌株接种LB平板37℃培养24～36h后，挑取2～3个单个菌落与100μl灭菌纯水研磨混匀，95℃10min，10000×g离心1min，取上清作为DNA模板。 　　1.3 GroEL基因扩增引物的选择 从GenBank中提取大肠杆菌的GroEL基因序列，运用DNASTAR软件选取细菌保守区进行引物设计，预计扩增产物占全长基因的2/3以利于细菌的变异性分析。引物序列是：P上游5AGTTACCCT（CT）GG（TC）CC（AG）AAAG3（对应于大肠杆菌GroEL基因84-103位核苷酸）；P下游5CAGCAACCACGCCTTCTTC3，（对应于大肠杆菌GroEL基因1240-1218位核苷酸）。扩增长度约为1.1kbp。 　　1.4 GroEL基因片段的扩增与纯化 50μl的PCR反应体系中含10×PCR buffer 5μl， 20mM dNTP 4μl，2mM MgCl23μl，上、下游引物各25pmol（1μl），菌株DNA模板1μl，Taq 酶5U（1μl），补加灭菌蒸馏水至50μl。 扩增过程为95℃变性5min，95℃ 60s、55℃ 90s、72℃ 120s循环40次，72℃延伸10min以扩增出所有目的菌株的GroEL基因片段。 　　1.5 GroEL基因片段扩增产物的酶切 运用DNASTAR软件，寻找扩增片段内的酶切位点，为便于进行PCR产物的鉴定，选择含单个酶切点的内切酶；为便于进行RFLP和SSCP分析，选择含多个酶切点的内切酶。结果选取限制性内切酶EcoRV进行GroEL基因片段的酶切分析，选取限制性内切酶PstⅠ进行GroEL基因扩增片段的RFLP和SSCP分析。20μl酶切反应体系含10×酶切缓冲液2μl，1mg/mlBSA 2μl，PCR纯化产物3μl（1μg），限制性内切酶1μl（3～4U），补足ddH2O至20μl，在37℃酶切2.5h。 　　1.6 RFLP分析 酶切产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶60V电泳2h，电泳结束后，用快速银染法染色，具体是：将电泳后的聚丙烯酰胺凝胶置固定液1（10%乙酸）中固定30min，用纯水洗3次，每次2min，然后置银染色液（0.1%AgNO3，0.036%甲醛）中染色20min，轻轻摇动，用纯水洗5～10s，在显色液（2.5%碳酸钠，0.036%甲醛，0.002%硫代硫酸钠）中显色3～10min至所需深度。终止液（1.46%EDTA）终止10min，固定液2（28.8%乙醇，16.7%甘油）固定10min，室温干燥2h，观察结果并照相。 　　1.7 SSCP分析 5μl酶切产物与5μl变性液（5mM EDTA，0.05%溴酚兰，0.05%二甲苯青FF溶于甲酰胺中）混匀，95℃变性7min，立即置冰上放置10 min，取3～4μl加样于10%聚丙烯酰胺凝胶（8.3cm×7.5cm），在Bio-Rad电泳仪上4℃100V电泳30min，280V电泳60min。电泳结束后行快速银染法染色。 　 　　2 结果 　　2.1 大肠杆菌