微波辐射对PC12细胞突触素I表达影响及其机制.docVIP

微波辐射对PC12细胞突触素I表达影响及其机制 　【摘要】 目的: 探讨微波辐射对PC12细胞突触素I表达及其磷酸化水平的影响, 并通过对其相关影响因子BDNF及其受体TrkB改变的探讨, 初步揭示突触素I改变的机制。方法: 采用30 mW/cm2微波辐射PC12细胞, 于辐射后1 h, 通过HPLC检测氨基酸递质释放的改变; 于辐射后3 h、 9 h、 1 d和2 d, 通过RTPCR、 Western blot和免疫细胞化学检测突触素I, BDNF和TrkB表达以及突触素I磷酸化的改变; 通过免疫共沉淀检测BDNF和TrkB相互作用的改变。结果: 30mW/cm2微波辐射后1h, PC12细胞释放的Asp、 Glu、 GABA和Gly均减少（Plt;0.01）; 突触素ⅠmRNA于辐射后3～9 h减少, 1 d增加（Plt;0.01或Plt;0.05）, 2 d基本恢复; 其蛋白于辐射后9 h～2 d减少（Plt;0.01或Plt;0.05）; 磷酸化的突触素Ⅰ在辐射后3～9 h减少, 1 d增加, 2 d又见减少（Plt;0.01或Plt;0.05）。BDNF mRNA于辐射后3～9 h减少, 1 d增加, 2 d又见减少（Plt;0.01或Plt;0.05）; 其蛋白于辐射后3 h减少, 1～2 d又见增加（Plt;0.05或Plt;0.01）。TrkB mRNA在辐射后3 h和2 d减少; 其蛋白于辐射后3 h～1 d增加（Plt;0.05或Plt;0.01）, 2 d基本恢复。BDNF和TrkB的相互作用于辐射后3～9 h增强, 1～2 d减弱（Plt;0.05或Plt;0.01）。结论: 微波辐射可引起PC12细胞氨基酸递质释放障碍, 突触素Ⅰ表达及其磷酸化水平降低, BDNF和受体TrkB表达及其相互作用异常, 参与微波辐射所引起的PC12细胞信息传递障碍及其修复过程。 【关键词】 微波 PC12细胞 突触素I BDNF TrkB 　　突触传递在突触可塑性中发挥重要作用, 大多神经递质和神经活性物质储存在突触囊泡中, 通过胞吐作用释放出来。囊泡锚定过程是突触胞吐的始发阶段, 这个过程需要磷酸化依赖的突触素参与。脑源性神经生长因子(brainderived neurotrophic factor, BDNF)可通过作用于其受体TrkB激活Ras/MAPK信号通路, 影响突触素Ⅰ的表达和磷酸化[1]。由于原代神经元的培养条件要求较高, 且细胞数量有限, 在基因水平干预较难操作, 故在实验研究中受到很大的限制。PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系, 在神经生长因子(nerve growth factor, NGF)诱导后作为较成熟的神经细胞培养模型, 已被广泛应用于神经细胞分化、 离子通道、 受体、 递质释放、 神经毒性等的研究[2]。因此本实验中以PC12细胞为模型, 对微波辐射后氨基酸递质释放、 突触素Ⅰ及其磷酸化水平、 BDNF及其受体TrkB的改变进行探讨, 为阐明微波辐射致突触传递改变的机制奠定实验基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 PC12细胞购自中国科学院细胞生物研究所细胞库, 由本室传代保存; DMEM培养基购自美国Invitrogen公司; 胎牛血清购自北京元亨圣马生物技术研究所; Asp、 Glu、 GABA和Gly购自美国Sigma公司; NGF、 兔抗突触素ⅠIgG和兔抗磷酸化的突触素ⅠIgG均购自美国Chemicon公司; 兔抗TrkB IgG购自武汉博士德生物工程有限公司; 兔抗BDNF IgG、 生物素化羊抗兔IgG、 HRP链亲和素和DAB均购自北京中杉金桥生物技术有限公司; 蛋白A琼脂糖购自美国Santa crutz公司; 用于BDNF、 TrkB、 突触素I和βactin PCR扩增的成对引物序列由北京奥科公司合成。 　　1.2 方法 　　1.2.1 PC12细胞培养 复苏PC12细胞, 传3代后, 采用0.05 mg/L NGF, 10 mL/L胎牛血清的DMEM诱导其分化, 7～14 d后可见其有明显突起长出, 用于下一步实验。 　　1.2.2 辐射方法 PC12细胞接种于35 mm培养皿中, 置于布满吸收材料的微波室内, 放在辐射台上接受辐射, 平均功率密度为30 mW/cm2, 辐射时间为5 min。假辐射组仅放置于辐射台上5 min, 不给予辐射。 　　1.2.3 高效液相色谱仪检测PC12细胞氨基酸递质释放 辐射后1 h, 收集细胞, 1000 r/mim离心10 min, 取上清; 加入100 g/L磺基水杨酸, 5000 r/min离心15 min; 取上清, 加入2 mol/L K