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两种产β-内酰胺酶细菌检测方法及耐药性探究 　【摘要】 目的：了解产β内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌和克雷伯菌属细菌的耐药性及比较两种ESBLs检测方法的临床应用。方法：使用双纸片协同试验、纸片表型确证试验检测2005年1月至2006年5月我院分离的302株克雷伯菌属细菌和大肠埃希菌，比较两种方法的检出率及其差异；使用国际标准平皿二倍稀释法测定148株产ESBLs细菌抗生素的耐药率、中介率、敏感率。结果：两种检测产ESBLs细菌方法比较检出率无明显差异；148株产ESBLs大肠埃希菌、克雷伯菌属细菌对亚胺培南、美罗培南均敏感，氨苄西林、哌拉西林、头孢唑林、氨苄西林/舒巴坦、头孢呋辛、复方新诺明、庆大霉素、头孢哌酮耐药率在60%以上。结论：纸片表型确证试验和双纸片协同试验是临床检出产ESBLs菌株最迅速、最简便、最经济的方法；产ESBLs大肠埃希菌和克雷伯菌属细菌对大多数广谱β内酰胺类抗生素高度耐药，亚胺培南、美罗培南是治疗产ESBLs大肠埃希菌、克雷伯菌属细菌的最佳药物。 【关键词】 β内酰胺酶；大肠埃希菌；克雷伯菌属；耐药性 　　致病菌对抗生素的耐药是临床抗感染治疗过程中经常面临的棘手问题。抗生素耐药不仅仅是一个重要的医学问题，且已经逐渐发展成为一个严重的社会问题。近年来，随着广谱β内酰胺抗生素，尤其是第三代头孢菌素的广泛使用，超广谱β内酰胺酶(ExtendedSpectrum βLactamases， ESBLs)所介导的β内酰胺抗生素耐药问题成为人们关注的焦点。产ESBLs克雷伯菌属细菌和大肠埃希菌引起的院内感染爆发流行在世界各地均有报道，大部分发生于重症监护病房(ICU)，但在肿瘤病房、血液科病房、儿科病房和老年慢性病病房也经常发生。近年来本院克雷伯菌属细菌和大肠埃希菌院内感染率不断增高，因此有必要明确产ESBLs克雷伯菌属细菌和大肠埃希菌感染发生率、耐药情况，以便采取有效措施加以控制。本文对2005年1月至2006年5月从门诊和住院患者的标本中分离的302株克雷伯菌属细菌和大肠埃希菌进行了ESBLs监测和研究。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 菌株 患者菌株：2005年1月至2006年5月本院各种临床标本中分离的223株大肠埃希菌和79株克雷伯菌属细菌。质控菌株：大肠埃希菌ATCC 25922敏感质控株；大肠埃希菌ATCC 35218酶抑制剂的质控株；肺炎克雷伯菌ATCC 700603(产SHV18)产ESBLs的质控株。 　　1.1.2 试剂 　　1.1.2.1 培养基 革兰阴性菌选择性培养基：中国蓝琼脂平板(英国Oxoid公司)；药敏培养基:MullerHinton琼脂平板(英国Oxoid公司)。 　　1.1.2.2 细菌鉴定试剂 肠杆菌科细菌生化鉴定编码管(杭州天和微生物试剂有限公司)；VITEK2革兰阴性菌鉴定卡IDGNB(法国生物梅里埃公司)。 　　1.1.2.3 抗生素纸片 CTX(30 μg/片)、CAZ(30 μg/片)、CRO(30 μg/片)、ATM(30 μg/片)、AMC(20/10 μg片)、TCC(75/10 μg/片)、CTX/CLA(30/10 μg片)、CAZ/CLA(30/10 μg片)(上述纸片均为Oxoid产品)。 　　1.2 方法 ESBLs检测及产ESBLs细菌耐药性检测 　　1.2.1 菌种鉴定方法 鉴定方法均经常规鉴定技术鉴定，疑难菌使用VITEK2微生物自动分析仪(法国生物梅里埃公司)进一步鉴定。 　　1.2.2 ESBLs检测方法 对所有临床分离大肠埃希菌、克雷伯菌属细菌分别用以下方法检测产ESBLs菌株。方法：双纸片协同试验筛选ESBLs菌株。 　　1.2.2.1 阿莫西林双纸片协同试验筛选ESBLs菌株 双纸片协同试验按标准纸片琼脂扩散法操作，制备菌悬液,涂布MuellerHinton琼脂平板。将含克拉维酸的阿莫西林/克拉维酸药敏纸片贴于MuellerHinton琼脂平板中心，头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、氨曲南4种纸片均匀贴于AMC的周围，与AMC纸片相距均为 25 mm(以纸片中心间距为准)，35 ℃孵育20 h～22 h。如任一纸片与AMC纸片间出现协同抑菌区(“坑”或“匙扣”现象)为协同试验阳性,否则为阴性。 　　1.2.2.2 替卡西林双纸片协同试验筛选ESBLs菌株 替卡西林双纸片协同试验操作、孵育、判定同1.2.2.1，将替卡西林/克拉维酸药敏纸片替代阿莫西林/克拉维酸药敏纸片贴于MuellerHinton琼脂平板中心。NCCLS纸片表型确证试验检测ESBLs菌株:参照NCCLS 2004的M2A8文件表2A，确证标准参照NCCLS 2004推荐的标准。 　　1.2.3 药物敏感试验方法 琼脂