猪关节软骨细胞体外培养及其形成糖胺多糖能力实验探究.docVIP

猪关节软骨细胞体外培养及其形成糖胺多糖能力实验探究 　 作者：许宏权，黄向莹，陈晓洁，王传家，纪影畅 【关键词】 软骨细胞；体外培养；糖胺多糖 　　［摘 要］ 目的：观察软骨细胞体外培养的情况及其合成糖胺多糖的特点。方法：通过Ⅱ型胶原酶消化法获得高活性的软骨细胞，定量接种6×106个细胞于培养皿，加入培养基，每周传代一次，连续5周，留取所有培养液用阿利新蓝法（Alcian Blue）测定软骨细胞外分泌基质糖胺多糖（GAG）的变化；利用倒置显微镜观察原代及传代软骨细胞的生长情况。结果：软骨细胞在ｐＨ值为7.0，含10%胎牛血清的DMEM培养液中生长良好，体外培养的软骨细胞从传代后合成糖胺多糖类基质，第二代传代细胞分泌GAG的能力最强。结论：软骨细胞体外培养生长良好，合成大量的糖胺多糖类基质。传代第二代是最佳接种时间。 　　［关键词］ 软骨细胞；体外培养；糖胺多糖 　　Pig Articular Chondrocytes in Culture form Glycosaminoglycan 　　Abstract：Objective To observe chondrocytes in culture forming glycosaminoglycan.Methods Chondrocytes was cultured in plate(6×106 cells) and generated each week.while bFGF were put in the culture liquid the total times is five.GAG of cell cultures was determined by DMS GAG colorimetry assay from the first to the fifth week.Results chondrocytes grew well in DMEM medium with pH 7.0,containing 10% fetal calf serum.This study showed that chondrocytes in culture was the activitivest during the second week,the chondrocytes were showed obviously synthesized more GAG from the second to the fifth week.Conclusion It indicates that chondrocytes in culture form more GAG,The second generation that hands down from generation to generation is the best vaccination time. 　　Key words:Chondrocyte；Invitro culture；Glycosaminoglycan 　　 　　外伤和疾病可导致软骨缺损，由于软骨细胞属于增生能力极弱的终末细胞，关节软骨损伤后的修复是极其有限的。利用组织工程化软骨修复软骨缺损是临床应用前景十分广阔的课题。本研究对体外培养的关节软骨细胞的外分泌基质进行连续定量检测，探讨其合成糖胺多糖类基质的能力。 　　1 材料和方法 　　1.1 动物与试剂 实验动物:贵州香猪(购自上海市第九人民医院动物实验中心)，体重(5±0.5)kg，雌雄不限。试剂:DMEM培养液，胎牛血清，0.15%的Ⅱ型胶原酶（美国Sigma公司）、0.25%的胰蛋白酶。 　　1.2 实验分组 软骨细胞每周传代一次，连续5周，共收集5组标本。 　　1.3 猪关节软骨细胞的提取 在无菌操作下，切下满月小猪膝、髋关节软骨，仔细剥离皮肤和软骨膜，用眼科剪将软骨组织剪成2 mm~3 mm大小的方块，置于离心管中，氯霉素冲洗液冲洗3次，再以磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗2遍后，加入两倍于软骨体积的0.15%Ⅱ型胶原酶（Sigma公司）在37 ℃恒温振荡器内消化。 　　1.4 收集细胞 3 h～4 h后第一次收集软骨细胞。将上述悬浊液倒入150目不锈钢滤筛滤去软骨组织，用于隔夜消化，第二天早上收集。过滤的液体2 000 ｒ/min离心8 min，轻轻吸除消化液，加入PBS液,漂洗1次,加入细胞培养液16 ml，振荡混和制作经过滤、漂洗、计数制成细胞悬液。锥虫蓝拒染实验观察细胞活力。 　　1.5 软骨细胞的培养 将软骨细胞悬液密度调整至6×106/ml，以1 ml分别接种于塑料培养皿，加入6 ml培养液（DMEM培养液加10%胎牛血清）。置入37 ℃恒温培养箱(5%CO2)培养［1］。 　　1.6 软骨细胞传代培养 细胞