荧光定量Taqman技术在检测乙肝病毒DNA中应用.docVIP

荧光定量Taqman技术在检测乙肝病毒DNA中应用 　【摘要】 目的：探讨荧光定量Taqman技术检测乙肝病毒（HBV）感染者乙肝病毒脱氧核糖核苷酸（HBVDNA）的临床意义，以及与乙肝表面抗原（HBsAg）、乙肝e抗原（HBeAg）的相关性。方法：采用荧光定量Taqman技术对76例乙肝感染者HBVDNA的检测。结果：在76例标本中，HBVDNA的阳性率为42.1%，HBsAg的阳性率为75.0%，HBeAg的阳性率为17.1%。结论：HBsAg、HBeAg反映HBV的复制状态存在局限性，HBVDNA定量检测是反映HBV复制和药物疗效的判断最直接可靠的指标。 【关键词】 乙肝病毒；荧光定量Taqman技术；应用 　　荧光定量Taqman技术是一种新的基因定量检测技术，该技术实现了核酸扩增(PCR)从定性到定量的飞跃，融会了PCR的高灵敏性，DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点，有效地解决了其他方法很难处理的PCR污染的问题，尤其在检测乙肝病毒DNA（HBVDNA）中的应用越来越受重视［1］。本文结合血清学指标乙肝两对半，初步探讨荧光定量Taqman技术在检测HBVDNA中的临床价值。 　　1 材料与方法 　　1.1 标本 乙型肝炎血清标本来自本院住院和门诊患者；正常血清标本来自本院输血科。用一次性试管收集血液，分离血清，置-40℃保存或立即检测。 　　1.2 荧光定量Taqman技术检测 　　1.2.1 仪器与试剂 仪器采用德国Roche Diagnostics GmbH公司的LightCycle PCR扩增仪。试剂采用上海克隆生物高技术有限公司乙型肝炎病毒（HBV）PCR荧光定量检测试剂盒。 　　1.2.2 技术原理 荧光定量PCR法采用了先进的Taqman 荧光探针技术，其试剂比常规PCR试剂多了一个寡聚核苷酸探针，这个探针带有一个荧光发光分子和一个荧光淬灭分子，完整的探针在激光下，发光分子所产生的荧光被淬灭分子全部吸收，样品无荧光，而PCR扩增中，Taq酶在链延长过程中，可通过自身的5’3’核酸外切酶活性降解与模板结合的特异性荧光探针，使荧光发光分子与淬灭分子分开，从而在激光下产生特定波长的荧光，这种荧光随着PCR扩增过程呈动态增强，可以检测到一个荧光增长曲线，通过测定荧光强度可进行起始模板的定量分析［2~4］。 　　1.3 标本、对照品的处理 血清标本，试剂盒阳性、阴性对照各取100 μl（冻存血清或对照品使用前在室温融解，振荡混匀10 s），分别加入100 μl核酸提取液A，振荡混匀10 s，13 000 r/min离心10 min，弃上清；分别加入25 μl核酸提取液B至沉淀中（核酸提取液B使用时一定要充分混匀，边振荡边将颗粒和液体一起加入沉淀中，其中颗粒量应在15%以内），振荡混匀10 s，100℃沸水浴10 min，13 000 r/min离心2 min。处理后的样品应在1 h内使用，或在-20℃~-80℃最长保存1个月（不宜反复冻融）。 　　1.4 试剂准备、加样和PCR扩增 　　1.4.1 试剂准备 按样品数n取HBV PCR缓冲液n×18 μl、MgCl2 n×3 μl、HBV荧光探针n×3 μl、Taq酶n×2 μl混于一离心管中，旋涡振荡器上振荡混匀10 s，低速离心数秒，按每管26 μl分装。 　　1.4.2 加样 将样品处理上清液（冻存样品使用前室温充分融化，振荡混匀数秒，13 000 r/min离心2 min）和定量校准品（使用前应先离心，再充分振荡混匀）1号~4号各4 μl分别加入反应管中，混匀后分别取20 μl移入专用毛细管中，低速离心数秒后置入Light Cycle，立即进行PCR扩增反应。 　　1.4.3 PCR扩增 反应管先在50℃反应1 min，然后94℃保温2 min，再按93℃ 3 s~60℃ 30 s循环40次。 　　　2 结果 　　2.1 乙肝两对半和荧光定量Taqman技术检测结果比较 乙肝两对半检测的HBsAg的阳性率显著高于HBeAg和荧光定量Taqman技术检测HBVDNA的阳性率（HBVDNA含量gt;4.2×102 copy/ml），而HBVDNA的阳性率要高于HBeAg的阳性率，见表1。 　　表1 HBVDNA、HBsAg、HBeAg的阳性率的比较（略） 　　2.2 乙肝两对半检测的HBsAg与 HBeAg及荧光定量Taqman技术检测HBVDNA的比较 HBsAg为阳性的患者的HBVDNA和HBeAg可能为阳性，也有可能为阴性,其中HBVDNA阳性率为52.6%（30/57），HBeAg阳性率为22.8%（13/57）；HBsAg为阴性的患者其HBVDNA和HBeAg一般都为阴性，但也有少数例外，检测中有2例HBs