2012―2013年河南地区PRRSV的多样性分析.docVIP

　　2012―2013年河南地区PRRSV的多样性分析 　　猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒 (porcine reproductive and respiratory syn-drome virus,PRRSV)引起的一种以母猪流产、早产、死胎和木乃伊胎等,仔猪和育肥猪发生呼吸道疾病为特征的传染病。 　　PRRSV是动脉炎病毒属(ar-terivirus)的成员,为单股正链RNA,约为15kb,共9个开放阅读框(ORF),分别编码2个非结构蛋白和7个结构蛋白。基因变异分布于整个基因组,尤其是NSP2和ORF5基因变异最大,常常作为病毒遗传变异和进化分析的靶基因。目前PRRSV主要包 括 以VR2332毒 株 为 代 表 的 美 洲 型 和 以Lelystad virus(LV)为代表的欧洲型2种基因型,我国大陆流行的病毒株主要为美洲型PRRSV。该病于1987年首次在美国发现,现已呈世界性分布。我国于1996年首次报道该病毒存在,随后流行于全国。自2006年夏秋季我国多个省份猪群暴发以高热、厌食、呼吸困难、高发病率和高病死率等为特征的猪高热综合征以来,陆续有文献证实该病是由PRRSV变异毒株NSP2缺失30个氨基酸的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)引起的。本研究主要对2012―2013年采自河南各地的54份PRRSV疑 似 病 料 进 行 核 酸 检 测 及PRRSV分离,并对阳性样品的NSP2和GP5基因进行序列扩增与分析,研究河南地区PRRSV流行株NSP2和GP5基因变异情况和发展趋势,了解河南地区PRRSV的多样性,为河南地区PRRS的防制提供参考依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 病料采集 　　采集河南省郑州、洛阳、鹤壁、新乡、焦作、济源等地共54份疑似PRRSV阳性病猪的脾脏、肺脏、淋巴结等脏器。 　　1.2 主要试剂Taq DNA聚合酶、鼠源反转录酶(M-MLV)、RNA酶 抑 制 剂 (Rnase Inhibitor)、dNTP、pMD18-T载体均购自大连宝生物工程有限公司,Trizol Reagent购自Invitrogen公司,DEPC购自Amresco公司,琼脂糖购自Sigma公司,Marc-145细胞为本实验室保存,胎牛血清购自北京四季青公司。 　　1.3 引物设计参考PRRSV CH-1a株(GenBank登录号AF132118)和JXA1株 (GenBank登 录 号EF112445)全基因序列应用Primer5.0软件分别设计针对GP5基因和NSP2高变区的特异性引物(表1),引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。【表1】 　　 　　1.4 病毒的分离与鉴定将采集的阳性病料经研磨、离心、过滤,接种于Marc-145细胞上培养3~5d,每天观察有无细胞病变(CPE)产生。将有病变的毒株传3~4代后用特异性PRRSV ORF5引物进行RT-PCR检测,同时利用PRRSV CH-1a株的GP5特异性单抗通过间接免疫荧光方法进行鉴定。将未出现CPE者,经冻融3次后盲传3~5代,有病变者按上述方法鉴定。 　　1.5 RNA的提取取病猪肺脏、脾脏、淋巴结等组织样本,用PBS进行稀释后研磨,冻融3次,8 000r/min离心10min后,取上清参照Trizol reagent说明书进 行 操 作,所 提 取 基 因 组RNA用30mu;L 1permil;DEPC水溶解,-70℃保存备用。 　　1.6 PRRSV NSP2基因和GP5基因的RT-PCR扩增提取上述部分阳性样品中的总RNA,首先以20mu;L体系反转录:RNA模板13mu;L,5Buffer 4mu;L,dNTP(10mol/mL)1mu;L,随机引物1mu;L(20mu;mol/L),RNA酶抑制剂(40U/mu;L)0.5mu;L,反转录酶M-MLV(200U/L)0.5mu;L。反应条件:42℃1h,95℃5min,得到的cDNA用于PCR扩增。 　　PCR按50mu;L反 应 体 系:10Buffer 5mu;L,MgCl2(25 mol/mL)5mu;L,反转录产物(cDNA)5mu;L,dNTP(10mol/mL)1mu;L,Taq DNA聚合酶0.5mu;L,上下游引物各1mu;L,补加灭菌双蒸水至50mu;L。 　　反应循环参数:95℃5min;95℃1min,56℃1min,72℃1.5min,共32个循环;最后72℃ 10min。反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。 　　1.7 PCR产物的克隆与测序分别将上述NSP2基因和ORF5基 因 扩 增 产 物 回 收 纯 化 后 克 隆 入pMD18-T载体,取PCR和酶切鉴定为阳性的克隆送北京华大基因公司测序,每个样本重复测序2次。