棉花育性恢复基因的克隆与表达载体的构建_0.docVIP

棉花育性恢复基因的克隆与表达载体的构建 1、相关定义 1.1、RNAi 的定义及特点 RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是近年来发展起来的新技术, 已成为目前分子生物学研究中最活跃的热点之一。它指由双链 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)诱导的序列特异性的转录后基因沉默机 制,能在多种生物中抑制特异基因的表达。 RNAi 所具有的特异性、稳定性、高效、快速以及不改变基因组的遗 传组成等特性为人们研究未知功能的基因提供了新的反向遗传学手段。 在拟南芥和水稻等基因组测序完成后,RNAi 这一新技术在植物功能基因 组学研究及植物的遗传改良等方面提供了一个强有力的手段。随着后基 因组时代的到来,需要大规模高通量地研究基因的功能。RNAi 技术作为 一项快速、高效、便于操作的使靶基因失活的技术可以非常有效地鉴定 特定基因的功能,表现出比反义和核酶等基因表达抑制技术更优越的特 性,因而正在成为功能基因组研究的有力工具。 1.2、基因操作的基本概念和技术原理 质粒:是一类在细菌细胞内发现的染色体外自主复制的环形双链 DNA 分子,有 些质粒还能整合到染色体基因组上面。 载体:可以用来插入外源 DNA 片段构建重组 DNA 分子并导入寄主活细胞的质粒 获噬菌体统称为基因克隆载体简称为载体 [17] 。 克隆:在分子生物学中,带有一段 DNA 插入序列的一个寄主(载体单位)(例 如细菌寄主中的重组质粒载体)。 表达载体:一类按特殊要求设计构建的,具有调节外源基因表达的转录及转译 控制信号的,并能使克隆基因在转化的寄主细胞中得到有效表达的专门载体。大肠 杆菌的表达载体可区分为表达型质粒载体和表达型噬菌体载体两种类型。 启动子:位于基因上有的一段具有特殊功能的 DNA 序列,RNA 聚合酶正是通过 它的结合作用而启动基因的转录。原核基因启动子具有-10 和-35 等结构元件,而 真核基因启动子则具有 TATA 盒及上游元件等特征性结构 [18] 。 转化:细菌的转化指细菌捕获游离的 DNA;并使此 DNA 编码的遗传信息组入细 菌染色体以成为永久遗传组成部分;正常的真核细胞由于受到致瘤病毒的感染而转 变成恶性细胞的过程也叫做转化;目前认为,凡外源 DNA 导入细胞的过程都可泛称 为转化 [19] 。 核酸的凝胶电泳基本原理:琼脂糖是一种线性多糖聚合物,系从红色海藻产物 琼脂中提取出来的。当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介 质,其密度是由琼脂糖的浓度决定的。经过化学修饰的低熔点的琼脂糖,在结构上 4 比较脆弱,因此在较低的温度下便会熔化,可用于 DNA 片段的制备电泳。凝胶的分 辨能力同凝胶的类型和浓度有关。琼脂糖凝胶分辨 DNA 片段的范围为 0.2~50Kb 之 间;而要分辨小分子量的 DNA 片段,则要用聚丙烯酰胺凝胶,其分辨范围为 1 个碱 基对到 1000 个碱基对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小,浓度越高 孔隙越小,其分辨能力也越强;反之,浓度越低孔隙越大其分辨能力也越弱。例如, 20%的聚丙烯酰胺凝胶分辨力可达 1~6bpDNA 小片段,而要分离 1000bp 的 DNA 片段, 则要用 3%的聚丙烯酰胺的凝胶。再如,2%的聚酯糖凝胶可分辨小到 300bp 的双链 DNA 分子,而对于较大片段的 DNA,则要用低浓度(0.3%~1.0%)的琼脂糖凝胶。 在凝胶电泳中,加入溴化乙锭染料对核酸分子染色之后,将电泳标本放置在紫外光 下观察,便可以十分敏感而方便地检测出凝胶介质中 DNA 的谱带部位,即使每条 DNA 带中仅含有 0.05 μg 的微量 DNA,也可以被清晰地显示出来。这是因为溴化乙锭 是一种具扁平分子的核酸燃料,可以插入到 DNA 获 RNA 分子的碱基之间,并且在 300nm 波长的紫外光照下放射出荧光,所以可以用来显现琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺 凝胶中的核酸分子。 PCR 技术的基本原理及特点 [20] :PCR 技术快速敏感简单易行,其原理并不复杂, 与细胞内发生的 DNA 复制过程十分类似。首先,双链 DNA 分子在临近沸点的温度 下加热时便会分离成两条单链的 DNA 分子,然后 DNA 聚合酶以单练 DNA 为模版 并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的 DNA 互补链。此外,DNA 聚合酶同样需要有一小段双链 DNA 来启动新链的合成。因此,新合成的 DNA 链的 起点,事实上是由加入在反应混合物中的一对寡核苷酸引物在模版 DNA 链两端的 退火位点决定的。这是 PCR 的第一个特点,及它能够指导特定 DNA 序列的合成。 在为每一条链均提供一段寡核苷酸引物的情况下,两条单链 DNA 都可作为合成新 生互补链的模版 [2