最新形式菌落物料的衍生耐菌物材的粒子解离净化工效研讨.docVIP

最新形式菌落物料的衍生耐菌物材的粒子解离净化工效研讨 凝固后用直径6mm的打孔器在每个平板上打六个孔，把相同体积的样品和对照液体（无菌水、青霉素）分别加进孔内。以无菌水作为阴性对照，青霉素作为阳性对照。12h后检测结果，有抑菌圈的为阳性，反之为阴性。每个样品做两个平板，测量各个抑菌圈直径后取平均值。　　菌种的发酵培养基菌种活化培养基：PDA培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1L）.种子培养基：葡萄糖30g，Na2HPO41g，KCl0.05g，（NH4）2SO418g，MgSO47H2O0.5g，FeSO40.01g，蒸馏水1L，pH7.0.发酵培养基：淀粉30g，Na2HPO41g，KCl0.05g，（NH4）2SO418g，MgSO47H2O0.5g，FeSO40.01g，蒸馏水1L，pH7.0.测试培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂20g，蒸馏水1L.　　发酵培养菌种活化：挑取保藏菌株的成熟孢子在PDA斜面上划线，28活化34d，待孢子成熟后转移到PDA斜面上相同条件培养4d.种子培养：将2mL无菌水加入斜面中，用无菌刮匙将斜面上的孢子刮下，转移到20mL带玻璃珠的无菌水中，用力震摇35min，制成孢子悬浮液。取10mL孢子悬浮液接入已灭菌的200mL种子培养液中，28，250rpm摇床培养1d作为种子。　　发酵罐培养：发酵罐：NBS公司Bioflo410小型发酵罐，总容积为7L，实际装液量5L发酵方法：在搅拌条件下将5L发酵培养基装入发酵罐中，118，20min在位灭菌，冷却至室温后通入无菌空气，在火焰保护下将500mL种子接入发酵罐中，进行发酵培养。　　接种量：10培养条件：30，pH=6.5，搅拌300rmin培养时间：80h1.5抗菌肽的分离纯化1.5.1发酵液的处理真菌发酵液经纱布过滤除菌丝后，12000rmin离心30min除去发酵液中较大颗粒物质，经0.45m膜过滤后用截留分子量为10000u的超滤膜超滤[4]，保留滤过液，冻干浓缩用于柱层析。　　发酵液的分离纯化SephadexLH-20柱层析将冻干后的1L发酵液用纯水溶成50mgmL，经0.45m微滤膜过滤除去不溶性杂质后用上样环每次精确上样1mL，考虑到下一步的分离纯化，宜以为流动相洗脱，流速0.8mLmin，检测波长为280nm，启动自动收集器，每管2mL收集流出组分，合并各个色谱峰后检测各自的抑菌活性，保留活性峰，-20冻存以备进一步分离。　　DEAE-SepharoseFF阴离子交换层析前期工作明AF2的等电点为3.6，在纯水中AF2带有负电荷，因此选用阴离子交换柱对其进行吸附并洗脱。将200mL经分子筛层析得到的活性物质经通道上样，流速1.5mLmin，检测波长280nm.洗脱过程分为4个阶段：a以纯水洗脱不保留组分并收集；b盐溶液线性洗脱，洗脱条件：A（纯水），B（1molLNaCl），在20个柱体积内B的浓度从0上升到30；c以B（1molLNaCl）对柱填料进行再生，共3个柱体积；d用纯水将盐溶液交换出。每管10mL收集流出组分，并检测各个吸收峰的抑菌活性，保留活性峰并冻干，保存于干燥器中。　　结果与分析分离纯化结果与分析SephadexLH-20层析结果发酵液冻干粉经分子筛层析后的色谱如1.从中可以看出超滤后的发酵液经SephadexLH-20层析后得到16六个组分，其中保留时间为39mL和44mL的组分（即色谱峰3和4）具有抗菌活性，但前一组分活性较差且得率较低，因此本文仅对对后一组分进行研究。收集此活性峰f1-4冷冻保存进行下一步分离纯化。活性物质产生的抑菌圈见2，中1为6gmL青霉素钠阳性对照，2和3为层析后的活性物质产生的抑菌圈，4和5为无菌水阴性对照。 中国过滤与分离公共技术服务平台 中国过滤与分离公共技术服务平台