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液相色谱知识及应用化学室车宝泉 第一部分:液相色谱简介 HPLC的仪器配置及流程 等度及高压梯度泵系统 由一个或数个高压泵组成 每台泵输送一种溶剂 扩展性强，组合灵活 特点: 一般可耐6000psi反压 流速在0.1到5ml/min 设定范围可低至1μl 或高至10ml 低压梯度系统 由一个高压泵组成 单泵可运行梯度 可运行三元或四元梯度 单键盘控制 需要较好的脱气方法 一般要氦气或脱气机脱气 水与有机溶剂混合时的粘度 液相色谱进展 1 仪器方面 仪器模块化，一体化， 毛细管HPLC 2. 仪器联用技术发展液相色谱－质谱液相色谱－核磁共振光谱 液相色谱-气相色谱等 第二部分 液相色谱常用的色谱柱 对液相色谱柱的了解 从色谱方法上分： 正相/反相，离子交换，分子体积排除，亲合，疏水回受 从柱子类型上分： 分配/吸附，离子交换，凝胶，亲合 从柱体积及柱结构上分： 内径∶ 微径柱2mm以下 分析柱3.9-7.8mm 制备柱7.9-50mm 长度∶5cm-60cm 从柱体材料上分： 不锈钢（普通/可换柱芯），玻璃，聚合物（径向加压） 高效液相色谱柱概况 液相色谱填料的种类 碳十八柱（ODS/C18） 碳八柱（Octyl/C8） 碳六柱（Hexyl/C6） 碳四柱（Butyl/C4） 碳一柱（Methyl/C1） 常见的吸附柱填料 硅胶柱 阴离子交换柱（SAX） 阳离子交换柱（SCX） 苯基柱（Phenyl） 氨基柱（Amino/NH2） 氰基柱（Cyano/CN/Nitrile） 不同品牌色谱柱 硅胶的基质不同 主要是硅胶的纯度差异 硅胶纯度越高，性能越好 含碳量不同（C%） 填料的表面积不同（m2/g） 端基封口与否 填料的孔径差异（?） 填料的颗粒度差异（μ） 色谱柱保护 过滤所有的溶剂和样品 使用保护柱 仪器在使用完毕，冲洗整个系统中的缓冲液 柱子不使用时，两端密封保存。 在适当的溶剂中保存色谱柱 注意色谱柱的pH使用范围，不用高压冲洗色谱柱，不再高温下过长时间使用硅胶键合相 第三部分:知识及应用 几个重要概念 液相色谱定性应用 液相色谱定量应用 概念:色谱条件 示例: 用氰基键合硅胶为填充剂；0.01mol/L庚烷磺酸钠溶液(用20％磷酸调节PH值至2.7－乙腈(1: 1)为流动相，检测波长为267nm。 正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组成、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组成的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体的色谱系统并达到系统适用性试验的要求。但对某些品种，必须用特定牌号的填充剂方能满足分离要求，可在该品种项下注明。 概念:系统适用性实验 理论板数按利血平计算应不低于2000，利血平峰与其它色谱峰的分离度应符合要求。 色谱中最难分离物质对或与其相关的物质对的分离度和待测物响应值的重复性是系统适用性试验的重要参数。 按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品对色谱系统进行试验和调整，应符合要求；或规定色谱条件下的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。 系统适用性实验 理论板数:（n） 量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半高峰宽（Wh/2）， 按n＝5.54（tR/Wh/2）2计算色谱柱的理论板数， 系统适用性实验 分离度 计算公式为： R= 2(TR2-TR1)/(W1+W2) 式中tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间； tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1及W2为此相邻两峰的峰宽。 除另有规定外，分离度应大于1.5。 系统适用性实验 重复性: 各品种项下的对照溶液，连续进样3～5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。 拖尾因子: 为保证测量精度，应检查待测峰的拖尾因子 （T）是否符合各品种项下的规定， 定性方法： 鉴别正反应： 通常在相同色谱条件下，供试品和对照品保留时间的偏差在2％以内，则鉴别正反应。 还可通过在供试品中加入对照品，供试品色谱峰无分岔现象来证明。 假阳性: 显色、沉淀 假阴性：检测限因素、样品复杂性干扰 应用实例 1. 食品、保健品中添加枸橼酸西地那非的鉴别。 2. 三七粉中添加 醋酸地塞米松的鉴别。 3. 抗癫痫中药添加苯巴比妥的鉴别。 4. 中药制剂中掺加降糖类西药的鉴别。 单一HPLC鉴别有局限性需结合以上方法可以和薄层色谱，二极管阵列检测器阵列。* 要做到100％确定，必须和质谱结合进行 光电二极管矩阵检测器 定量方法：HPLC为首选容量分析、紫外光谱法的局限性实例醋酸地塞米松片：紫外光谱法不