DNA操作技术.ppt

DNA操作技术主要有：切割、连接、缩短、加长、转录成RNA，或者合成新的DNA，化学修饰、或者去掉特殊的化学基团。这些分子操作技术，不仅是基因克隆的基础，也是研究生物化学、基因结构、基因表达调控研究的基础。 学习内容： DNA操作酶 核酸酶 连接酶 聚合酶 DNA修饰酶 限制性内切酶 分类和命名 酶切体系、反应条件、结果鉴定 定位酶切位点 连接 1. DNA操作酶 核酸酶：剪切、缩短、降解核酸 Bal31 E. coli外切酶III S1 内切酶 DNase I RNase H 连接酶：连接核酸分子 聚合酶：复制 修饰酶：增加或去除化学基团 拓扑异构酶：引入或去除超螺旋的闭合环状DNA 1.1 核酸酶 1.1 核酸酶 1.1 核酸酶 1.1 核酸酶 1.1 核酸酶 1.1 核酸酶 RNase H（E. coli） 降解RNA:DNA杂交分子中的RNA。 1.2 连接酶 1.2 连接酶 T4-DNA连接酶 连接粘性末端、平端 修复双链DNA或RNA-DNA杂交双链上的缺口。 E. coli DNA连接酶 连接粘性末端（主要用于cDNA第二链的合成） T4-RNA连接酶 1.3 聚合酶 依赖DNA的DNA聚合酶 不依赖DNA的DNA聚合酶（末端转移酶） 依赖RNA的DNA聚合酶（反转录酶） 依赖DNA的RNA聚合酶 不依赖DNA的RNA聚合酶 1.3 聚合酶 DNA聚合酶I 5’-3’聚合酶活性 3’-5’外切酶活性 5’-3’外切酶活性 核酸内切酶活性 可以被枯草杆菌蛋白酶水解成：Klenow片段和N端具5’-3’外切酶活性的分子。 1.3 聚合酶 1.3 聚合酶 1.3 聚合酶 T4 DNA聚合酶 与Klenow酶相似，外切酶活性更高。体外诱变反应中效率很高。 T7 DNA聚合酶 测序酶 Taq DNA聚合酶 1.3 聚合酶 逆转录酶：将mRNA转录成cDNA AMV逆转录酶（鸟类成髓细胞性白血病病毒） DNA聚合酶活性 RNase H活性 DNA内切酶活性 核酸结合活性 M-MLV逆转录酶（Moloney鼠白血病病毒） 1.3 聚合酶 两种逆转录酶的区别 肽链的组成 禽酶2条肽链，具聚合酶和很强的RNase H活性 鼠酶1条，较弱的RNase H活性 反应的最适温度 禽酶42°C，二级结构丰富RNA，禽酶效率高 反应的最适pH值 禽酶pH 8.3 鼠酶pH 7.6 1.4 DNA修饰酶 碱性磷酸酯酶（来自于大肠杆菌或小牛肠道）可以去掉DNA分子的5‘端的磷酸基团。 polynucleotide kinase: 来自于T4侵染的大肠杆菌，在5’端增加磷酸基团。 末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl tansferase） 来自于小牛胸腺组织，在DNA分子的3‘端增加一个或多个脱氧核苷酸。 甲基化酶具有完全相同的识别序列。 1.4 DNA修饰酶 甲基化酶: 大肠杆菌中的甲基化酶 dam甲基化酶 在5GATC3的腺嘌呤N6位上引入甲基，可使一些识别顺序中含有5GATC3的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的DNA如BclI（TGATCA），但BamHI（GGATAA）则不会因为N6A的甲基化而失去活性。 dcm甲基化酶 此酶在序列5‘CCAGC3’或5‘CCTGG3’中间的胞嘧啶C5上引入甲基，受其影响的限制性内切酶是EcoRII 1.4 DNA修饰酶 甲基化酶在基因工程中用途 许多II类限制性内切酶，都存在着相对的甲基化酶，它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上，从而使免受切割。 如：M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）的甲基转移到EcoRI识别顺序中的第三位腺嘌呤上，从而使DNA免受EcoRI的切割 。 1.4 DNA修饰酶 末端脱氧核苷酰转移酶（TDT） 3’端突出的双链DNA，Mg2+ 平端或3‘凹端的低物，Co2+ 1.4 DNA修饰酶 T4--多核苷酸激酶（T4-PNP） 将γ-磷酸转移到DNA或RNA的5’端 放射性标记DNA的5’端 连接反应中，使缺少5’端磷酸的DNA片段和接头磷酸化 1.4 DNA修饰酶 碱性磷酸酶（BAP, CIP） 作用于载体的5’端，提高重组效率 作用于外源DNA的5’端，防止自连 1.5 拓扑异构酶 在共价闭合双链上通过磷酸二酯键的短暂断裂和重新连接解开超螺旋 在EDTA溶液中也有活性 2 限制性内切酶 2 限制性内切酶 Restriction Endonuclease催化双链DNA分子的断裂，产生限制性片段。 不同来源的DNA具有不同的酶切位点以及不同的位点排列顺序，因此各种生物的DNA均呈现特征性的限制性酶