常规真及核表达与鉴定.pptVIP

* 常规真核表达与鉴定 ——刘宗梁 2013-10-19 * 一、真核表达概述； 二、常用真核表达系统； 三、细胞与载体的选择； 四、哺乳动物细胞转染； 五、Western-blot法对转染结果的检测； 六、间接免疫荧光法（IFA）对转染结果的检测； 七、Cell-ELISA法对转染结果的检测； 主要内容： * 一、真核表达概述 1、真核表达：通过将外源基因克隆到真核表达载体，并转染到合适的真核细胞中，最终获得外源目的基因高效表达产物的过程。 2、真核表达相对原核表达的优点：在真核表达的过程中，可以通过真核细胞的转录及修饰系统（如甲基化修饰、糖基化修饰、乙酰化修饰等）获得具有一定构象和生物活性的蛋白质；表达目的蛋白更的结构及生物学功能（如免疫原性等）更接近于该蛋白的天然状态，且表达的蛋白不存在原核表达中“包涵体”这一现象。 3、真核表达缺点：表达量低，一般难以持久表达。 * 二、常用真核表达系统 1、毕赤酵母表达体系：酵母细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但纯化难度大。 2、慢病毒表达系统：商品化的慢病毒表达系统（如Lenti-X）在病毒包装时获得VSV-G泛嗜性重组慢病毒，通过膜质偶联和膜质融合的方式感染靶细胞，可感染几乎所有类型的哺乳动物细胞。 3、哺乳动物细胞表达体系：对蛋白的加工与修饰与酵母及昆虫表达系统完全不同，可通过脂质体等直接将外源表达质粒导入哺乳动物细胞，进行表达。哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白，但其表达量低。 * 4、杆状病毒昆虫细胞表达体系：蛋白表达水平高，可长晶体，多用于蛋白结果与功能的研究，但重组质粒构建及融合十分复杂。 * 三、细胞与载体的选择 1、常用于表达的哺乳动物细胞：COS-7、BHK、293T、Sf-9、Sf-21等，具体选择可根据实际需要或者表达载体所含的表达原件等进行选择。 2、表达质粒的选择：常用的真核表达质粒有pCAGGS、pCDNA 3.1、 pEGFP等（均为SV40 origin）。 3、某些特殊的表达载体：如反向遗传表达载体，昆虫表达系统载体等。 * 四、哺乳动物细胞转染 1、引物设计：构建重组真核表达质粒，一般在引物设计时首先会在引物中引物一些能够促进蛋白表达（如Kozak序列）或者便于后期检测的序列或标签（如flag、HA、His等），注意这些序列在引物中的位置。 2、实验材料：真核表达细胞系、DMEM、FBS、OPTI-MEM、PBS、trypsin、携带有外源基因的重组质粒（去细胞内毒素法抽提）、转染试剂（或仪器）、细胞计数器、盖玻片、六孔板等。 3、转染细胞密度约2～5×106/mL,一般在细胞铺板后12～18h内进行转染，转染的质粒要测定浓度，按2ug/孔进行。 * 细胞转染步骤 ——以DFV-E基因转染cos-7细胞为例 1、cos-7细胞消化后计数，铺六孔板，培养12～24h，观察细胞生长情况，至适宜密度 (铺板后的细胞尽可能在24h内进行转染，一般选择过夜)即可进行转染。 2、质粒及脂质体处理 　（1）及脂质体 ：脂质体为4、6、8uL/孔（脂质体+OPTI-MEM，250ul/1.5 tube，孵育5min） 　（2）质粒：质粒终浓度分别为2、3、4ug/孔（质粒+OPTI-MEM，250ul/1.5 tube，不需孵育，在脂质体孵育5min中的过程中，把质粒配好） * 3、将第二步中（2）加入（1）中，混匀，不要剧烈吹打，孵育20min（在两者作用的20min时间内，洗涤细胞） 4、细胞的洗涤：先弃掉原培养液，以维持液DMEM（未加血清）洗涤两遍1mL/孔；再用OPTI-MEM洗涤一遍，约1mL/孔。细胞洗涤也可用预热的PBS或者Hanks液洗涤，最后一遍洗涤最好使用维持液。 5、将六孔板中的以上液体弃掉，再加入1.5mL的OPTI-DMEM； 将孵育的脂质体及质粒（500uL/孔）均匀 滴入其中，轻摇六孔板使之混合均匀。 * 6、将六孔板放入培养箱，一般5～6小时后换液，具体是否要换液根据细胞具体生长状态进行调整。 7、弃去原培养液，补加2mL/孔的OPTI-MEM，或者加入2mL/孔的含10%血清的DMEM培养基，继续培养至36～48h。 8、培养至48h后收细胞即可停止培养，然后进行表达蛋白的鉴定。若用IFA法检测，则在此处即可进行细胞固定；若进行Western bolt法检测，则此处需要将细胞消化下来，裂解，然后进行SDS，最终通过WB检测。 9、转染时注意做空白细胞对照和空质粒转染对照。 * 五、Western-blot法对转染结果的检测 1、培养至48h后收细胞(视细胞状态决定何时收集细胞)，弃去六孔板中的培养液，