微生物来源的几丁质酶抑制剂的分离纯化及其活性研究.pdfVIP

微生物来源的几丁质酶抑制剂的分离纯化及其活性研究 摘 要 几丁质酶是降解几丁质的关键酶类，在多种真菌和昆虫的生长及发育过程 中起重要作用，以其为靶标的新型生物杀虫剂和抗真菌剂成为了国内外关注的 新热点。 本研究建立在从全国各地共34份土样中初筛具有几丁质酶抑制性活性的 菌株库基础上，通过复筛从中筛选出活性菌株33株，根据几丁质酶抑制剂的活 性和分离纯化探索，对活性菌株A1001 、A1002和B11-24产几丁质酶抑制剂展开 分离纯化及其活性研究。 菌株B11-24是革兰氏阳性杆状细菌，根据生长曲线测定，在8-20h期间处于 对数快速生长期，产几丁质酶抑制剂最佳时间在 14-18h期间。菌株B11-24 发酵 液经过甲醇浸提、中性氧化铝柱层析、DEAE- 纤维素52柱层析、硅胶柱层析和 Sephadex G25柱层析等分离手段，HPLC检测谱图在1.3min时出现一个纯度约为 90% 的物质。该物质的温度和pH 耐受性比较好，在水和甲醇中易溶。 菌株A1002 在第2-3天处于对数生长期，产几丁质酶抑制剂最佳时间在第5 天或第6天。其发酵液经过甲醇浸提、DEAE- 纤维素52柱层析、2 次硅胶柱层析、 和Sephadex G 25柱层析等分离纯化方法，HPLC检测谱图4.3min 处有主要物质 峰。该活性物质对温度和pH 耐受性以及溶解性与菌株B11-24产物相似。 通过活性追踪的方法对菌株A1001 产几丁质酶抑制剂发酵液进行分离纯 化，经过分级乙醇醇沉、DEAE- 纤维素52柱层析、sevag试剂除蛋白和Sephadex G25柱层析获得一种纯的活性物质，HPLC 检测谱图显示在 15.9min，通过红外 光谱、质谱、1H-NMR 以及特征反应，判定该活性物质为一种多糖。同时，采 用曲面响应法对菌株A1001 发酵条件进行优化，Plackett - Burman实验确定了影 响发酵条件的主要因素，爬坡实验确定中心点，中心组合实验做进一步优化， 优化后几丁质酶抑制剂产量提高36.8% 。 最后，对活性菌株A1001 、A1002和B11-24产几丁质酶抑制剂进行杀虫实验 和抗菌实验。结果显示，三者通过注射方法对蚕蛹的致死效果明显，且LD50 都 在10-4 g/mL 水平上，其中菌株A1002产几丁质酶抑制剂的活性较高，而通过喷 射方法效果均不理想；抗菌实验表明，三个菌株中只有菌株B11-24产几丁质酶 抑制剂对酵母有抑制活性。 本研究结果为进一步研究活性菌株产几丁质酶抑制剂的分离纯化和活性研 究等提供了基本依据。 关键词：几丁质酶抑制剂；分离纯化；响应曲面法优化；活性 The Study on Purification and Activity of Chitinase Inhibitors of Microbial Origin Abstract Chitinases, the key enzymes on degradation of chitin, played an important role in the growth and development of a variety of fungi and insects. Now the research in new bio-pesticides and antifungal agents had become a hot spot. In this study, a total of 34 soil samples around the country were screened to establish a strain library with chitinase inhibiting activity, and then 33 active strains were obtained by rescreening . The chemical constituents an