工程酵母细胞高压破碎蛋白低温保藏和去糖基化-中国医药生物技术.PDFVIP

中国医药生物技术 2014 年 10 月第 9 卷第 5 期 Chin Med Biotechnol, October 2014, Vol. 9, No. 5 381 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.05.013 ·技术与方法· 工程酵母细胞高压破碎、蛋白低温保藏 和去糖基化处理对 7-木糖紫杉烷糖基 水解酶 LXYL-P1-2 活性的影响 陈天娇，朱平 紫杉醇主要来源于红豆杉，作为一种“重磅炸弹”式的 England BioLabs 公司；蛋白定量染色液购自美国 Bio-Rad 抗肿瘤药物，自 1992 年 12 月被美国 FDA 批准上市以 公司；配制以下蛋白纯化溶液： 来，一直是销售额最大的植物抗肿瘤药。但由于紫杉醇的天 Buffer A ：2 ml 1 mol/L Tris-HCl （pH 8.0 ）、25 ml 2 mol/L 然含量极低，约占含量最高的树皮部位的万分之二，加之红 KCl 、2 ml 1 mol/L 咪唑、69.44 μl 14.4 mol/L β-巯基乙醇、 豆杉生长缓慢，早期从野生红豆杉中获取紫杉醇曾给红豆杉 10 ml 甘油，加蒸馏水定容至 100 ml ； 资源造成毁灭性破坏。目前主要依靠化学半合成或苗圃栽培 Buffer B ：2 ml 1 mol/L Tris-HCl （pH 8.5 ）、5 ml 2 mol/L 手段制取。苗圃栽培虽然对保护野生红豆杉资源具有积极 KCl 、69.44 μl 14.4 mol/L β-巯基乙醇、10 ml 甘油，加蒸馏 意义，但栽培红豆杉中紫杉醇含量低微的本质没有发生改 水定容至 100 ml ； 变。另一方面，红豆杉中存在着大量的紫杉醇结构类似物， 5 ml 2 mol/L Buffer C ：2 ml 1 mol/L Tris-HCl （pH 8.5 ）、 其中包括含量数十倍于紫杉醇的 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇， KCl 、69.44 μl 14.4 mol/L β-巯基乙醇、10 ml 甘油，加蒸馏 而后者在脱除木糖基之后形成的 10- 去乙酰紫杉醇仅需在 水定容至 80 ml ； C10 位乙酰化即可产生紫杉醇[1] 。如能将这类副产物转变成 各种浓度的咪唑洗脱液：用 Buffer C 作为溶剂对 紫杉醇，不仅可以减少其对环境的污染，还可以“变废为宝”， 1 mol/L 咪唑进行稀释获得。 大大提高红豆杉资源的利用率。脱除木糖基可用化学法或生 1.1.3 设备与仪器 APV-2000 型高压细胞破碎仪购自德 物酶法来完成，其中后者的专一性强、环境友好。但由于天 国 SPX 公司；P300 型超微量分光光度计购自德国 Implen 然细胞中 β-木糖苷酶的酶量普遍偏低，用筛选得到的微生 公司；镍亲和层析填料购自美国 GE Healthcare 公司；岛津 物直接进行转化效率不高[2-3] ，本实验室已尝试用基因工程 Labsolution 分析型高效液相工作站购自日本 Shimadzu 公 方法解决这一问题。我们已从具有转化 7-木糖-10-去乙酰 司；电热恒温水箱购自北京长风公司；FE 20 型 pH 计购 紫杉醇为 10-去乙酰紫杉醇能力的真菌香菇中克隆得到了 自瑞士 Mettler 公司；Zorbax Bio Series GR-450 分离柱购 7-木糖紫杉烷糖基水解酶 LXYL-P1-2 ，该酶隶属于糖基水 自美国 Agilent 公司。 解酶的第 3 家族，是一种