核酸提取对临床荧光PCR检测质量的影响因素.docVIP

核酸提取对临床荧光PCR检测质量的影响因素 中国人民解放军第302医院 王海滨 一、临床分子生物学检验面临的问题与挑战 （一）国家药监局审评中心新行规：核酸提取是关键！ 1. HBV DNA 敏感性报告 30IU/ML ，防止实验室污染问题！ 2. 标本加样量不少于 200 微升；干扰与敏感性的矛盾！ 3. 核酸加样量不少于 20 微升、反应体积不少于 40 微升！ 4. 磁珠法应用的挑战！血站核酸筛查？ 5. 定量内标漂移对结果的影响 6. 试剂盒考核：增加抗污染和敏感性能评价指标！ （二）不同核酸提取方法对检测质量的影响 影响核酸提取的因素有很多，以磁珠法、层析柱法、碱性裂解法及生物合成材料进行比较。 标本： 200 微升血清 方法：磁珠法：市场销售试剂盒，介质为胍盐、乙醇； 层析柱法：市场销售试剂盒，介质为胍盐、乙醇； 碱性裂解法： PEG 介导； 生物合成材料：无胍、无醇。 PCR 扩增：取等体积提取核酸或磁珠悬液（ 10 微升），同一 PCR 扩增液。 我们采用四种方法材料进行同一样本核酸提取，然后采用统一试剂对相同提取核酸进行 PCR 扩增，结果差别非常大，磁珠法和层析柱法基本差不多，层析柱法稍微滞后于磁珠法，碱性裂解法最差，而且 100IU 无结果。复合材料的敏感性，是磁珠法或层析柱法的 30 倍左右。 过去，我们对荧光 PCR