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荞麦米仁检验规程
前 言
本标准由内蒙古出入境检验检疫局提出并归口。
本标准起草单位:中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局,中华人民共和国满洲里出入境检验检疫局。
本标准主要起草人:杨永生、刘玮琦、董奇彪、张贵、刘振伟、郭铁筝本标准附录均为资料性附录。
本标准不涉及任何专利信息。
马铃薯粉痂病菌的检疫鉴定方法范围
本标准规定了马铃薯粉痂病菌的检疫鉴定方法。
本标准适用于马铃薯种薯、食用薯以及夹带土壤中马铃薯粉痂病菌的检疫和鉴定。
术语和定义
下列术语和定义适用于本标准
休眠孢子囊 resting sporangium
本菌指由休眠孢子集合成的中空的海绵状球体,称为休眠孢子囊(孢子团)。
游动孢子zoospore
具有鞭毛可以游动的孢子。多见于某些藻类和真菌。既能进行无性生殖,也进行有性生殖。本菌的游动孢子近球形,无胞壁,顶生不等长的双鞭毛,在水中能游动;静止后成为变形体,从根毛或皮孔侵入寄主内致病。游动孢子及其静止后所形成的变形体,成为本病初侵染源。
原理
马铃薯粉痂病菌分类地位
马铃薯粉痂病菌(Spongospora subterranea (Wallr.)Laerh.)属鞭毛菌亚门(Mastigomycotina),根肿菌纲(Plasmodiophoridae),粉痂菌属(Spongospora)。可侵染马铃薯薯块,引起粉痂英文名potato powdery scab,简称马铃薯粉痂病。
鉴定原理
马铃薯粉痂病菌在寄主上的症状、分离病原菌的形态学特征是制定本标准的主要依据。
仪器和用具
仪器
体视显微镜,生物显微镜(具测量功能),电子显微镜,天平(感量0.001g),超净工作台,光照生物培养箱,高压灭菌锅,离心机,样筛,冰箱。
用具
烧杯,三角瓶,量筒,试管,离心管,培养皿,载玻片,盖玻片,接菌针,移液器,镊子,刀片,酒精灯,镜头油等。
试剂和培养基
试剂
本标准所用试剂为化学纯
0.5%的甲基蓝溶液(C37H27N3O9S3.Na2)、 NaH2PO4·2H2O、 Na2HPO4·12H2O、 25%戊二醛水溶液(C5H8O2)、 1%酸性品红(C20H17O9N3S3Na2)、 20%醋酸(CH3COOH)
培养基
0.3%的水琼脂培养基
鉴定方法
症状检
马铃薯粉痂病菌主要为害块茎及根部,有时茎也可染病。块茎染病初在表皮上现针头大的褐色小斑,外围有半透明的晕环,后小斑逐渐隆起、膨大,成为直径35mm不等的“疤斑”,其表皮尚未破裂,为粉痴的“封闭疤”阶段。后随病情的发展,“疤斑”表皮破裂、反卷,皮下组织现桔红色,散出大量深褐色粉状物(孢子囊球),“疤斑”下陷呈火山口状,外围有木栓质晕环,为粉痂的“开放疱”阶段。根部染病于根的一侧长出豆粒大小单生或聚生的瘤状物。
显微镜检验
将感病薯块在自来水下冲洗干净,室温下自然晾干。用刀片在病斑的不同部位进行徒手切片,将切好的病组织放入0.5%的甲基蓝溶液中染色3 min,取出后用灭菌水冲洗2~3次,显微镜下观察。
扫描电子显微镜检验
0.2 mol/L磷酸缓冲液由A液30.5 mL,B液19.5 mL配制而成,其pH为7.0。
A液:0.2 mol/LNa2HPO4溶液,电子天平准确称取Na2HPO4·12H2O 35.82 g,加双蒸水充分溶解,准确定容至500 mL。
B液:0.2 mol/LNaH2PO4溶液,电子天平准确称取NaH2PO4·2H2O 15.6 g,加双蒸水充分溶解,准确定容至500 mL。
2.5%戊二醛固定液的配制:取25%戊二醛水溶液10 mL,0.2 mol/L磷酸缓冲液50 mL,加双蒸水至100 mL,配制成2.5%戊二醛固定液,分装入1.5mL离心管中,置于4℃冰箱中保存,备用。
用刀片从发病薯块病斑的不同部位切片取样,迅速用滤纸包裹后,放入分装好的固定液中进行固定,一般固定时间为7 d。扫描电子显微镜下观察。
番茄幼苗诱饵法检验土壤中的马铃薯粉痂病菌
通过毛刷或水洗(少量水)方法小心收集块茎表面土壤,并注意收集包装内外散落的土壤。土壤样品重量在500g~1000g左右,将土样风干、研细、过筛,除去石块等杂质,取底层筛下土壤,备用。
1 g土壤加入到1 000 mL 0.3%的水琼脂中配成土壤液。将培育50 d的健康番茄幼苗移栽到装有灭菌蛭石的育苗钵中,每株番茄幼苗加10 mL土壤液,每个处理20株,室温下培育,7 d浇1次营养液,30 d左右检查番茄根系,镜检(Flett,1983)。根毛感染多发生在番茄根的尖端至2-4cm位置上,观察番茄根用酸性品红按1%比例溶于20%醋酸中的染色液中浸渍数分钟,水洗后再显微镜(100倍)下镜检。
鉴定特征
病菌侵染马铃薯块茎鉴定特征
光学显微镜和电子显微镜分别观察取自马铃薯上的病斑切片,可以观察到大量休眠孢
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