细胞示踪技行术与应用(GFP).ppt

* Thanks！ * * GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强，特别在450～490nm蓝光波长下更稳定。 GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。 GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白。 由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。 * 长崎核爆幸存者 * 生活在日本沿海水域和沙地中的小海萤（Cypridina hilgendorfii）的透明外壳中含有一种生物，这些生物在受到骚扰时会释放出蓝色荧光物质。在二次大战期间，日本人曾搜集这些生物好让士兵能在夜里观看地图和其他信息。 名古屋大学 平田义正教授 * 还发现了另一种蛋白，它在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下发强烈绿色。其后他们仔细研究了其发光特性。 《细胞和比较生理学杂志》 水母素aequorin 仍是荧光酶的一种 生物发光现象，下村修和约翰森以前就有人研究。萤火虫发荧光，是由荧光酶（luciferase）作为酶催化底物分子荧光素（luciferin），有化学反应如氧化，以后产生荧光。而蛋白质本身发光，无需底物，起源是下村修和约翰森的研究。 下村修用水母提取发光蛋白时，有天下班要回家了，他把产物倒进水池里，临出门前关灯后，依依不舍地回头看了一眼水池，结果见水池闪闪发光。因为水池也接受养鱼缸的水，他怀疑是鱼缸成分影响水母素，不久他就确定钙离子增强水母素发光。其后Ridgway和Ashley 提出可以用水母素来检测钙浓度，创造了检测钙的新方法。钙离子是生物体内的重要信号分子，水母素成为第一个有空间分辨能力的钙检测方法，是目前仍用的方法之一。 * 水母素在钙刺激下发光，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光 * 普腊石1992年发表GFP的cDNA后，不做科学研究了。他申请美国国家科学基金时，评审者说没有蛋白质发光的先例，就是他找到了，也没什么价值。一气之下，他离开学术界去麻省空军国民卫队基地，给农业部动植物服务部工作。当时他如果花几美元，就可以做一个一般研究生都能做，但是非常漂亮的工作：将水母的GFP基因放到其他生物体内，比如细菌里，看到荧光，就完全证明GFP本身可以发光，无需其它底物或者辅助分子。 Prasher自己现在在一家汽车销售商那里帮忙开车送客人，一个小时挣10美元的工资。 将GFP表达到其它生物体这项工作，1994年由两个实验室独立进行：美国哥伦比亚大学做线虫的Marty Chalfie实验室，和加州大学圣迭哥分校、Scripps海洋研究所的两位日裔科学家Inouye和Tsuji。 * 将GFP表达到其它生物体这项工作，1994年由两个实验室独立进行： 美国哥伦比亚大学做线虫的Marty Chalfie实验室， 加州大学圣迭哥分校、Scripps海洋研究所的两位日裔科学家Inouye和Tsuji。 * 改造GFP，有多项发现。世界上用的大多数是钱永健实验室改造后的变种，有的荧光更强，有的黄色、蓝色，有的可激活、可变色 * 为了更加直观地观察生物膜 荧光显微镜观察 * 为了更加直观地观察生物膜 荧光显微镜观察 * 李京宝 2011.11.25 细胞示踪技术与应用 (green fluorescent protein ,GFP) * 主要内容 GFP GFP的研究历史 GFP的应用 学习要点 基本特性 机遇与重视 开阔视野 * GFP —— 基本性状 * 简介 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP 最早是由下村修等人在1962年在水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧光。 由水晶水母（Aequorea victoria）中发现的野生型绿色荧光蛋白，395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm * 分子结构 238aa,单链 ; 二聚体, β-桶状结构; 单体：11个β-折叠包围一个α-螺旋； β-桶状结构直径约3nm，高约4nm，规则的氢键带 ； 其末端的短α螺旋以及环状结构一起组成一个单独的致密结构域 ； * 发光机制 生色基团附着于α-螺旋上，几乎完美的包被