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第二章微生物的纯培养和显微技术 第一节 微生物的分离和纯培养 1. 无菌技术 2. 用固体培养基分离纯培养 3. 用液体培养基分离纯培养 4. 单细胞（孢子）分离 5. 选择培养分离 6. 二元培养物 一、无菌技术 无菌技术：在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其它微生物污染的技术。 它是保证微生物学研究正常进行的关键 1·1 微生物培养的常用器具及灭菌 常用器具：试管、玻璃烧瓶、平皿等器皿都要灭菌 培养基：培养微生物营养物质。 最常用的灭菌方法 1.干热灭菌：一般玻璃用具，如培养皿、吸管等用报纸包好后，放烘箱中，使温度逐渐升至150～160℃，保持2小时后，关闭电源，使缓慢冷却（降温太快时玻璃易碎），即灭菌完毕。 ①常压法（间歇灭菌法）：是用蒸汽锅（或普通锅）蒸，温度不超过100℃。每次一小时，共三次，每次间隔24小时（杀死孢子）。 3. 过滤除菌法 本法系用滤过方法除去活的或死的微生物的方法，是一种机械除菌的方法。本法主要用于对热极不稳定的药物小针剂或冻干粉针制剂的除菌。 除菌过滤器采用孔径分布均匀的微孔滤膜作过滤材料，为保证阻止细菌和细菌孢子通过滤器，滤膜的孔径一般不超过0.22μm。 对于接种针或其它金属用具灭菌，可直接在酒精灯火焰上烧至红热。此外在接种过程中，试管或三角瓶口，也采取通过火焰达到灭菌的目的。 ① 70％的酒精：操作前手或器皿的表面杀菌，载玻片，盖玻片的浸泡等。 ② 1:1000 新洁尔灭溶液，浸泡时间为30分钟，常用于表面的消毒。 ③ 福尔马林（40％甲醛液）：用于空间熏蒸灭菌，加热或加高锰酸钾使其放出甲醛气体。注意将空间密闭并维持24小时。 6. 紫外线灭菌 用于接种室等空气灭菌。 压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广 电热干燥箱：干热消毒（160 ℃ ，2小时）。主要用干玻璃器皿消毒 滤器：过滤除菌，大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台：为操作提供无菌环境 紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒 1·2 接种操作 —最基本技术 超净台 二、用固体培养基分离纯培养 菌落（colony） ：由单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度后，形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。 菌苔(lawn)：固体培养基表面众多菌落连成一片，呈片状，这就是菌苔。 二、用固体培养基分离纯培养 纯种微生物的分离 在自然界中，各种各样的微生物总是混杂在一起的，要研究和利用某一微生物，就必须把它同其他微生物分开，才能得到只含有同一种微生物的纯种微生物。这种方法叫纯种微生物的分离 大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。 二、用固体培养基分离纯培养 纯种微生物的分离方法 稀释倒平板法 涂布平板法 平板划线分离法 稀释摇管法 稀释倒平板法 稀释：先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1,000、1:10,000......）； 倒平板：然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板； 培养：保温培养一定时间即可出现菌落。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。　 2. 涂布平板法 先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板； 将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面； 经培养后挑取单个菌落； 3. 平板划线法 4. 稀释摇管法(dilution shake culture method） 三、用液体培养基分离纯培养 一些细胞大的细菌、许多原生动物和藻类等，需要用液体培养基分离来获得纯培养。 四、单细胞分离 五、选择培养分离 2 富集培养 土悬液—培养基+硫磺—分离出硫杆菌 土悬液—以羟基苯甲酸为唯一碳源的培养基——分离出能降解羟基苯甲酸的微生物。 六、二元培养物 纯培养物：只含有一种微生物的培养物叫做纯培养物。 混合培养物：含有两种以上微生物的培养物叫做混合培养物。 二元培养物: 培养物只含两种微生物，并有意识保持两者之间 的特定关系的培养物为二元培养物。 例如寄生于细菌细胞内的病毒与细菌一起培养。对于病毒来说，二元培养物是在实验室控制条件下可能达到的最接近于纯培养的培养方法。 七、微生物的保藏技术 菌种保藏目的：给微生物一特定的条件，使其不污染、不改变特性而存活下来。 菌种保藏方法 传代培养保藏——隔绝空气低温保