流式细胞技术的应用及相关问题探讨.PDF

流式细胞技术的应用 及相关问题探讨 中山三院 中心实验室 一、流式细胞仪工作原理 二、荧光染料选择 三、样本制备 四、数据分析处理 五、流式技术生命科学中的应用 流式细胞技术及工作原理 在流动的状态中快速 Injec 检测颗粒各种物理及 tor Sheath 生物特征的新型分析 Tip fluid 技术和分选技术； 样品的液流技术 Fluorescence signals 细胞分选和计数 数据采集和分析 Focused laser beam 流式技术是综合高科 技技术的结晶 流式细胞仪原理 流式细胞仪原理 检测信号 散射光信号 前向散射光信号(FSC) ：与激光束方向同轴的称 前向角散射光信号 侧向散射光信号(SSC) ：与激光束垂直的称为侧 向角散色光信号 荧光信号 流式细胞仪原理 前向角散射光信号（FSC） FSC反映细胞大小，一般来说， 细胞越大，前向角散射光信号 越强； FSC信号与细胞的折射率有关； 可用于表示细胞的凋亡； 区分死/活细胞时，可用于设门 流式细胞仪原理 侧向角散射光信号（SSC ） SSC信号主要反映了细胞的内部结构，内部结构越 复杂，SSC信号越强； 流式细胞仪原理 R1 流式细胞仪原理 特征荧光信号 当荧光抗体或标记其他染料染色的颗粒通过 激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返 回基态时，染料释放出能量，大部分以光的 形式释放。这种发射出的光称为荧光。 流式细胞仪原理 激光光源波长: 488nm FITC PE, PE-CY5/Pro-CP 635nm APC 样本制备 可检测的样本种类多样 (1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体组织，培 养细胞 (2) 血清、血浆、培养上清、细胞裂解液 标本制备 细胞悬液制备 荧光标记 样本制备 直接标记 新鲜全血荧光抗体标记 溶血－－溶血素（室温） 洗细胞－－PBS（低速离心） 固定－－固定液 间接标记 分离PBMC,制备单细胞悬液， 6- 7 细胞计数浓度10 10 冻存/新鲜PBMC标本荧光抗体标记 肝、脾、淋巴节扁桃体等组织 新鲜组织标本经胰酶消化制备单细胞悬液 溶血 Ficoll梯度离心获得P