广西规模猪场引起猪呼吸道疾病细菌性病原检测.docVIP

广西规模猪场引起猪呼吸道疾病细菌性病原检测 　　摘 要：运用PCR方法结合细菌分离鉴定，对2008～2010年广西48家规模猪场采集的368份组织样品进行了猪链球菌（SS）、产毒素多杀性巴氏杆菌（T+PM）、败血性波士杆菌（Bb）和猪副嗜血杆菌（HP）病原学检测。结果显示：阳性组织样品101份，占27.45%（101/368）；其中SS、T+PM、Bb和HP感染阳性样品分别占9.24%（34/368）、5.71%（21/368）、7.88%（29/368）和4.62%（17/368）。二重或多重混和感染样品共98份，占 94.74%（98/101）。SS、T+PM、Bb和HP的混合感染样品分别为33、21、27和17份，多与猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）和猪圆环病毒2型（PCV2）混合感染。可见SS、T+PM、Bb和HP在我区规模猪场依然存在，且常常与病毒尤其是PRRSV和PCV2以混合感染方式存在。 关键词： 细菌分离鉴定；PCR；链球菌；产毒素多杀性巴氏杆菌 中图分类号： S858.28 文献标识码： A 近年来，随着猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）和猪圆环病毒2型（PCV2）在我国猪群的持续感染，猪的免疫抑制性疾病的危害日渐明显和严重，规模化猪场的疾病越来越复杂。猪呼吸道疾病已成为养猪生产的主导疾病，发病率达30%～80%，死亡率达5%～30%以上，给养猪业造成了严重的经济损失。引起呼吸道疾病的主要病原除PRRSV、猪瘟病毒（CSFV）和猪流感病毒（SIV）等病毒病外，还包括以下细菌性病原体如：猪链球菌（SS）、产毒素多杀性巴氏杆菌（T+PM）、败血性波士杆菌（Bb）和猪副嗜血杆菌（HP）等。这些病原体常常以混合感染方式感染猪群。尤其是在猪只感染了病毒性病原后往往会继发感染细菌性病原体，造成更高的死亡率。可见，这些细菌在引起猪呼吸道疾病中同样起着重要的作用，应引起重视。为了解广西猪群中SS、T+PM、Bb和HP的感染状况，本研究运用细菌分离鉴定结合PCR诊断方法，对2008～2010年期间采集自广西48个有呼吸道疾病病原感染的规模猪场的368份组织病料进行了检测。现将结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 样品来源 2008～2010年期间，采集广西65规模猪场，有呼吸道疾病症状病猪组织样品281份，每份样品包括心、肺、脾、肾等内脏器官以及鼻拭子、关节液和胸腹腔积液。 1.2 培养基的制备 葡萄糖肉浸液肉汤液体培养基：1000mL葡萄糖肉浸液肉汤，加入3%脑心浸粉和10%健康马血清；含1%NAD TSA（胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂）培养基：1000mLTSA中加入1%NAD和5%新生牛血清；含1%NAD TSB（胰蛋白胨大豆肉汤）培养基[1]：1000mLTSB中加入1%NAD和5%新生牛血清；血红素呋喃唑酮改良麦康凯琼脂（HFMA）培养基[2]：1000mL麦康凯琼脂培养基中，添加1%的呋喃唑酮二甲基甲酰胺溶液0.5mL（呋喃唑酮最后浓度为5μg/mL），10%牛或绵羊红血球裂解液lmL（最后浓度为1：1000） 立即充分摇匀，后分装。注：上述培养基均在配置好基础培养基之后至56℃时按V/V或W/V的比例无菌加入添加物，最后分装后均置4℃保存。 1.3 试剂和引物 细菌总DNA的提取用Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒，购自日本Biospin公司；目的片段的扩增采用2×Taq PCR MasterMix试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司； DL2000 DNA Marker购宝生物工程（大连）有限公司自公司。微型生化鉴定管和药敏纸片均购自杭州天和微生物试剂有限公司生产。检测使用的4对参考引物如下：SS上游引物：5’-aatgttcaagtcaaccgtgg-3’，下游引物：5’-acatggaagggcaatatcag-3’，预期扩增的片段长度为725bp[3]；T+PM上游引物：5’-TGATTGGGACTTGCTAAAT-3’，下游引物：5’-CTTCTTCCTTATTGCCATA-3’，预期扩增的片段长度为347bp；Bb上游引物：5’-AGCTGGACGACGCCATGAAGG-3’，下游引物：5’-TTGCAGGATCTGGTTCTTGG-3’，预期扩增的片段长度为188bp；HP上游引物：5’-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3’；下游引物：5’-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3’，预期扩增的目的基因片段长度为822bp[4]。以上5对引物均由上海生工合成。 1.4 细菌分离及鉴定 无菌取疑似病猪的有特征性病变部位接种于特定的固体培养基上培养，选取疑似菌落，经染色镜检，生化试验进行初步鉴定后