10第三章 DNA重组技术与基因.ppt

;分 切 接 转 筛 检;第二章 DNA重组技术;二． 获得目的基因的方法：;一 目的基因的用途;(二) 聚合酶链式反应制备目的DNA（PCR/RT-PCR ） ;PCR扩增可获生物样品细胞某一基因 主要应用范围： 1.合成特异基因、特异探针 2.诊断带有异常外源基因（病毒）、 变异基因（遗传病、肿瘤） 研究精确结构、调节控制位点，以及1-2kb 的cDNA基因不可取。 长链DNA可人工合成短链后连接。 设备：PCR仪、特异引物及反应体系 ;(三)基因组文库/ cDNA文库中获得;1. 基因组文库中筛选目的基因;;（1）构建基因组文库筛选目的基因;;2.构建cDNA文库筛选目的基因;;;CDNA文库获得正在表达的基因 主要应用范围 ：1基因结构功能调节研究 2表达合成某肽或蛋白质 3.研究进化与同源性； 4.对比研究异常基因； 备注：有组织特异性; 有多种cDNA文库商品出售,扩增用试剂盒,合成片段较方便 ;3.目的基因的筛选 核酸杂交法; ;对照组的总RNA提取mRNA完整性鉴定 ;差异性条带的回收与第二次扩增 ;以差异性条带为探针克隆出基因组文库中的基因序列及cDNA文库中的全长cDNA序列 ;Polymerase Chain Reaction;mRNA差异显示法获得目的基因 ;(四)化学方法合成DNA片段;;四.目的基因序列测定（略）;;第二节 重组体的导入和筛选 ;1. 粘性末端连接;;;3.人工接头连接 ;;（二 ）连接反应条件;二.重组子导入受体菌;转 化;转 化;2.转化：对数生长期受体菌 0℃、低渗CaCl2 溶液悬浮10` 离心去上清 加入连接反应物 混匀、冰浴30’ 短时热休克（42℃）45-90`` 立即冰浴 富营养培养，质粒复制 筛选 ;转 染;转导;三.重组子的筛选与鉴定;（一）有否外源基因插入 （重组子遗传表型筛选） ;;（二） 根据重组子结构特征筛选;（二） 根据重组子结构特征筛选鉴定;核酸电泳; 凝胶电泳中,溴化乙锭（EB）--ethidium bromide染色，紫外光下发出荧光 肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带 ;胶浓度（%）;2. 插入片段方向性：如以表达为目的，需联合酶切方法，保证插入方向正确;3. PCR筛选： 基本确认目的基因插入否和DNA大小 4.杂交： 重组的DNA中，外源DNA一定条件下能和与其互补的DNA探针（标记）进行互补结合，使重组子表现出所带标记信号，据此可与非重组子区别。对插入目的基因进行确认。 特异性序列确定 ; 1） 菌落杂交和噬菌斑杂交； 2）dot blot：转化子DNA点样在膜上，进行杂交 3） Southern blot： 重组子DNA -- RE消化—电泳分离— Southern转移——变性中和—与探针杂交。 ;6. 表位筛选;文库中提取基因 提取基因 PCR扩增 扩增的产物鉴定（电泳） 回收 PCR产物酶切（EcoRI，BamHI） 片段克隆 连接（PUC18） 重组子筛选（PCR或电泳、紫外） 转化、筛选阳性克隆 阳性克隆 扩增 重组克隆鉴定 提取质粒，酶切 测序;;量程的选择－移液器;;核酸定量;第四章 重组体在宿主细胞中表达与调控 Gene Expression;基因表达的调节;第一节 外源基因在原核细胞中表达 ; ;原核表达系统的重要元件（一）DNA复制及质粒DNA;Promoter;（二）目的基因的表达： 1.启动子:指导宿主转录目的基因,能被宿主RNA聚合酶识别、结合的特定短