免疫球蛋白提取技术免疫球蛋白ImmunoglobulinIg-中国试剂网.PDF

中国试剂网 3.11.7.26 免疫球蛋白提取技术 免疫球蛋白（Immunoglobulin Ig ）的含量代表着机体体液免疫的水平，并进一步 代表着B 细胞的功能，因此测定血清Ig 含量可以推知机体的体液免疫功能和诊 断某些疾病引起的Ig 的过高和过低。 随着免疫学的发展和需要，免疫球蛋白的纯化和其成分的提纯成为必不可少的手 段。纯化的方法很多，有单一法，但大多数采用二步法以上相结合的方法，特别 是以硫酸铵提纯为基础，再经过层析柱的方法来提高免疫球蛋白及其各成分的纯 度最为常用。 硫酸铵溶液能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷而使之沉淀下来（称为盐析）。不 同浓度的硫酸铵盐析蛋白成分不同，利用这一原理提取所需的免疫球蛋白成分。 盐析只能粗提，为了获得纯化的免疫球蛋白成分，必须进一步采用层析的方法进 行分离。 免疫球蛋白包括IgG、IgM 、IgA、IgE 和IgD 。 一、 IgG 的分离与提纯 （一）材料与试剂配制 1．动物血清 2 ．硫酸铵饱和溶液 硫酸铵 800g~850g H2O 1 000ml 加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28 ％NH4OH 调 pH 至7.0 （不调pH 值也可以）。 注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如 次品必须除去重金属，可在溶液中通入 H2S ，静置过夜后滤过，加热蒸发 H2S 即可。 3 ．0.01Mol/L pH7.4PB 液 A 液：0.10Mol/L NaH2PO4 液 NaH2PO4•2H2O 15.60g 加H2O 至 1 000.ml 中国试剂网 3.11.7.26 B 液：0.10Mol/L Na2HPO4 液 Na2HPO4•12H2O 35.80g 加H2O 至 1 000ml 取A 液19ml，B 液81ml 加水至1 000ml 即可。 4 ．1％BaCl2 溶液 5 ．纳氏液 HgI 115.00g KI 80.00g 加H2O 至 500.00ml 溶化后过滤，然后再加20 ％NaOH500.00ml ，混合即可。 6 ．0.50 Mol/L 的HCl 液和0.50 Mol/L 的NaOH 液。 7 ．洗脱液：0.03Mol/L 的NaCl 液。 8．透析袋（或玻璃纸）。 （二）操作方法 1．取20ml 血清，加生理盐水20ml ，再逐滴加入(NH4)2SO4 饱和溶液10ml，使 成20 ％(NH4)2SO4 溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置30min 。 2 ．3 000r/min 离心20min ，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。 3 ．在上清液中再加（NH4 ）2SO4 饱和溶液30ml，使成50 ％（NH4 ）2SO4 溶液， 充分混合，静置30min 。 4 ．3 000r/min 离心20min ，弃上清。 5 ．于沉淀中加20ml 生理盐水，使之溶解，再加(NH4)2SO4 饱和溶液 10ml，使 成33 ％(NH4)2SO4 溶液，充分混合后，静置30min 。 6 ． 3 000r/min 离心20min ，弃上清，以除去白蛋白。重复步骤5，2~3 次。 7 ． 用10ml 生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。 8． 透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于4 ℃透析24h ，中间 换液数次。 以1％BaCl2 检查透析液中的SO42-或以纳氏试剂检查NH4+ （取3~4ml 透析液， 加试剂1~2 滴，出现砖红色即认为有NH4+存在），直至无 SO42-或NH4+ 出现为止。也可采用SephadexG25 或电透析除盐。 中国试剂网 3.11.7.26 9 ． 离心去沉淀（去除杂蛋白），上清液即为粗提IgG