微卫星分子标记开发操作指南..docVIP

微卫星分子标记开发操作指南 1、250ng DNA酶切（DNA必须比较纯） 反应体系：ddH20 17.25μL 10X buffer R 2.5μL MseⅠ(10U/ μL ) 0.25uL（ 2.5U） DNA(50ng/μL) 5μL 总反应体系25μL , PCR仪 内37℃ ,3h酶切,65℃，15分钟失活。电泳检测：1.5%的琼脂糖，150V 电泳20min，点样量约9μL-10μL，剩余的15μL用于连接。 2、酶切后的产物连接。 反应体系： ddH20 8.8μL MseⅠ接头 1uM (3μL) 即1pmol/μL 0.405nmol/μl = 405 pmol/μl T4 buffer 3μL T4 DNA ligase(5U/ μL ) 0.2μL(1u) 酶切后DNA 15 μL 总反应体系30μL , PCR仪 内37℃ ,2h或21℃，过夜连接，65℃10min失活。 MseⅠ接头5’-TACTCAGGACTCAT-3’/ 5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’ 接头：10μL 100pmol/μL+90μLddH2O=100μL 10pmol/μL 3、连接的产物用灭菌蒸馏水稀释10倍（10μL酶切产物+90μL水） 4、稀释的连接产物预扩增。 反应体系： 无菌水 9.6μL Taq DNA聚合酶 buffer 1 X 2μL MgCl2 1.5mM 2μL MseⅠ-N primer 120ng 1μL dNTPs 200uM 0.2μL Taq DNA聚合酶 0.4U 0.2μL 稀释的连接产物 5 μL 5μL 总反应体系20μL。 反应条件为： 94℃ 30s， 53℃ 60s，72℃ 60s，14-26个循环（循环数需优化14-17-20-23-26） MseⅠ-N 引物为：5’-GATGAGTCCTGAGTAAN-3’，N表示包括所有4种可能的选择碱基N=A，T，C，G,1.5%琼脂糖电泳检测 5、最佳反应条件下，PCR重新扩增一次，获得几百ng的扩增产物，试剂盒纯化。 6、杂交 * 5’端生物素化的探针的选择：常见的几种探针： （AC）15，（CT）15，（GA）15，（CAA）10，（AAG）8，（GATA）7，（ACCT）6 *250 ng -500 ng扩增的DNA与50-80 pmol 的生物素化的探针混合，加入总体积100 μL的SSC X4.2和SDS 0.07%中（即 21μL SSC X10加0.7 μL SDS 10%，加水至100 μL）。2 μg的DNA与200pmol 的探针在终体积500μL终浓度0.5 X SSC 溶液中，60℃杂交2小时。 * 95℃ 3min变性，室温，15min退火 7、富集 纯化的带接头的DNA（2-2.5微克）约30-50μL，95℃变性5分钟，与3’端生物素化的（CA）10或（GA）10 或5’生物素化探针（60℃杂交2h）mg 的磁珠用TEN100（10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 100mM NaCl, pH 7.5） * 15000转，离心1min，（以便查找失败原因） *非严格冲洗： 加入400μL的TEN1000（（10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 1M NaCl, pH 7.5）, 室温下轻柔混合5min，15000转，离心1min，上清转移至另一管中保存备用。重复2次。